余书奇，晏日安，陈文锐，奚星林，刘 青，邵仕萍

(1.暨南大学 理工学院，广东 广州 510000;2.广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，广东 广州 510623)

乙偶姻(Acetoin)的化学名称为3-羟基丁酮，是酵母发酵的副产物，存在于酒精发酵的饮料中。乙偶姻也是杂菌对碳水化合物代谢的主要副产物之一，当葡萄原料腐败染杂菌或病变，浆果上生长诸如醋酸菌等有害菌，或酿造过程中染杂菌时，可能导致葡萄酒中乙偶姻的含量超出正常范围。而过多的乙偶姻可通过氧化产生双乙酰，使酒精饮料出现酸败的味道，是影响感官质量的重要风味物质［1－2］。

目前，国内外报道食品中乙偶姻的检测方法主要为气相色谱法［3－9］，而液相色谱法的报道较少。有报道采用溶剂提取食醋中的乙偶姻后直接经紫外光谱检测［1，10］，由于乙偶姻在紫外吸收处无特异性，干扰大，从而影响其回收率。乙偶姻含有酮基，可采用2 4-二硝基苯肼衍生后产生黄色的苯腙，在特定波长内检测。目前国内外研究中，2 4-二硝基苯肼与醛酮反应主要应用于甲醛等物质的检测［11－16］。Ken等［9］通过实验发现乙偶姻的前体物质α-乙酰乳酸能够在实验条件下部分转化成乙偶姻。本实验采用2 4-二硝基苯肼进行柱前衍生，建立了适于葡萄酒体系中总乙偶姻(即游离乙偶姻及α-乙酰乳酸转化生成的乙偶姻)含量的测定方法，应用此方法，分析比较了正常发酵和异常发酵葡萄酒中总乙偶姻的含量，为判断葡萄酒品质提供了参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Waters e2695液相色谱仪(配有Waters 2998二极管阵列检测器及Empower数据处理系统，美国Waters公司);恒温水浴箱(Julabo TW 20);振荡器(IKA MS 3);0.45 μm滤膜。

乙偶姻标准品(纯度＞99.9%，Supelco公司);乙腈(色谱纯，美国Dikma公司);2 4-二硝基苯肼(纯度＞99.0%);盐酸、乙酸钠(分析纯)。

0.19%的2 4-二硝基苯肼(DNPH)溶液:称取DNPH 150 mg用适量乙腈溶解定容至100 mL;1 mol/L盐酸溶液:取9 mL盐酸，加水定容至100 mL;5.0 g/L乙酸钠溶液:取0.5 g乙酸钠溶于适量水，加水定容至100 mL。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件 Ultimate C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，流动相为乙腈－水(55∶45)，流速1.0 mL/min，柱温30℃，检测波长363 nm，进样量20 μL。

1.2.2 衍生条件 由于干红样品中乙偶姻含量高于干白样品，干红样品取0.2 mL进行衍生反应，干白样品则取1 mL进行衍生反应。向样液中加入0.1 mL 1 mol/L盐酸溶液和2 mL 0.19%DNPH，加水定容至5 mL;加塞后混匀，室温或30℃水浴1 h。冷却后加入5 mL乙酸钠溶液，混合均匀，过0.45 μm滤膜，滤液供液相色谱测定。

1.2.3 自酿葡萄酒方法 取葡萄2组，每组5份，每份500 g。一组葡萄品质良好，无破损腐败颗粒，标记为1#～5#。一组葡萄颗粒破损腐败，标记为6#～10#。葡萄去梗，带皮破碎，转入容器中，室温下进行第1次发酵，时间为7 d。转移发酵液，并压榨葡萄渣，将发酵液和压榨液混合均匀后密封进行第2次发酵，澄清后密封装瓶，待检测。

2 结果与讨论

图1 反应酸度对乙偶姻峰面积的影响Fig.1 Effect of reaction pH value on peak area of acetoin

2.1 衍生条件的优化

2.1.1 衍生溶液的酸度 DNPH的衍生反应为亲核加成，是酸性催化反应。体系的酸度对衍生能否完全非常重要。实验考察了pH值分别为1.0、1.5、2.0、3.0、4.0时衍生产物苯腙的含量，结果如图1所示。由图1可知在酸度减弱的情况下，衍生强度先略微增加后降低。原因可能为过多的氢离子与氨基结合，形成铵离子的衍生物，使得DNPH丧失了亲核能力。因此实验确定pH 1.5为最佳反应酸度，即加入0.1 mL 1 mol/L的盐酸溶液。

2.1.2 衍生剂的用量 根据衍生反应的比例关系及衍生剂需适当过量的原则，在1 mL 10 mg/L标准品中分别加入1.0、1.5、2.0、2.5、3 mL的DNPH进行衍生反应，结果如图2所示。加入2.5 mL DNPH时，衍生产物含量达到最大值，但此时会产生不溶性的黄色物质，使标准曲线相关系数(r)值下降。而加入2.0 mL DNPH时，衍生产物接近最大值，无不溶性物质生成，r值达到0.999以上，回收率较高，因此选择加入2.0 mL DNPH。

图2 DNPH用量对乙偶姻峰面积的影响Fig.2 Effect of DNPH amount on peak area of acetoin

2.1.3 衍生反应时间 考察了衍生时间分别为20、40、60、90、120 min时对衍生产物峰面积的影响，发现产物苯腙的含量在反应60 min后达到最大值，因此实验选择60 min为最佳衍生时间。

2.1.4 衍生温度 分别选择20、30、40、50、60℃温度进行试验，结果表明衍生效率随着温度的升高而降低，在20～30℃时，衍生产物的产率高且较为稳定，因此选择室温(20～30℃)作为最佳衍生温度。

2.2 衍生后的样品前处理

由于衍生后溶液的酸度较高，对柱子的使用寿命不利，因此尝试采取以下2种方法对衍生后的溶液进行试验。

2.2.1 有机溶剂提取 加入二氯甲烷5 mL，涡旋振荡萃取1 min，取出上层溶液，再分别用2 mL和3 mL二氯甲烷再次萃取，合并3次萃取的下层溶液。将萃取溶液在40℃下氮吹15 min至干，再用二氯甲烷定容。由于氮吹后试管内壁附着的黄色物质用乙腈、甲醇、乙酸乙酯等试剂均不能完全溶解，影响回收率，且萃取消耗有机试剂多，步骤繁琐，因此不采用本方法进行提取。

2.2.2 缓冲溶液调节pH值 向衍生溶液中加入5 mL左右的5.0 g/L乙酸钠溶液，使得溶液pH值为5.0，上机检测，并与pH 1.5的色谱图进行比较，结果显示，衍生产物无分解，响应值不变，因此选择加入缓冲溶液进行衍生后处理。

2.3 色谱条件的选择

2.3.1 流动相的选择 分别考察了以甲醇－水和乙腈－水为流动相时的色谱分离效果，结果显示以乙腈－水为流动相时，峰形尖锐无拖尾现象，且基线平稳，而有机相改为甲醇后，响应值降低，峰形拖尾，且出峰时间延后。因此选择乙腈－水为最佳流动相。

图3 葡萄酒样品的液相色谱图Fig.3 Liquid chromatogram of wine sample

2.3.2 流动相的比例 考察了乙腈－水的体积比分别为70∶30、65∶35、55∶45、45∶55时葡萄酒样品目标峰与杂质峰的分离情况。结果表明，流动相中乙腈比例的提高可以加快分离过程，但乙腈比例太高时，目标峰与附近的杂质峰无法基线分离，对目标峰造成干扰。当流动相中乙腈和水的体积比为55∶45时，目标峰与附近杂质峰的分离度为1.2，目标峰的保留时间为7.343 min，分析时间较短(如图3所示)。因此，本实验采用流动相乙腈和水的体积比为55∶45。

2.3.3 流速与柱温的选择 考察了流速在0.5～1.2 mL/min范围时对待测物分离的影响，结果表明，流速为1.0 mL/min时，峰的分离度佳且分析时间短。进一步考察了柱温的影响，分别在柱温为25、30、35℃时对样品进行检测，结果表明柱温30℃时基线平稳且分离度佳。

2.3.4 检测波长的选择 通过二极管阵列检测器在200～700 nm波长范围内进行扫描，衍生产物的光谱图见图4。目标物在363 nm处有最大吸收，且无其它物质干扰，因此实验选择363 nm为最佳检测波长。

2.4 线性范围、检出限与定量下限

分别吸取一定体积的乙偶姻标准溶液，配制成质量浓度为 0、1.0、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0 mg/L的系列乙偶姻标准工作液，取1 mL采用“1.2.2”方法进行衍生，按照“1.2.1”方法进行色谱分析。以质量浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标求得线性回归方程为Y=184 377X－260.25，相关系数(r)为0.999 9。图5为30.0 mg/L标准品的色谱图，按3倍信噪比计算方法的检出限为0.5 mg/L，按10倍信噪比计算方法的定量下限为1.67 mg/L。

2.5 精密度与回收率

随机选取干红和干白葡萄酒样品进行乙偶姻的加标回收实验，干红样品中乙偶姻的本底浓度为21.2 mg/L，共设25、50、75 mg/L 3个加标水平，干白样品中乙偶姻本底浓度为3.0 mg/L，设置3、6、9 mg/L 3个加标水平。同一加标水平平行做6次实验，计算回收率和RSD，结果见表1。干红样品的加标回收率为95%～106%，RSD为2.3%～3.4%;干白样品的加标回收率为94%～104%，RSD为2.5%～3.1%。

图4 乙偶姻衍生产物的紫外可见光谱图Fig.4 UV－Vis spectrum of derivatization production of acetoin

图5 乙偶姻标准溶液的色谱图Fig.5 Chromatogram of derivatization production of acetoin standard

表1 葡萄酒样品中乙偶姻的加标回收试验结果Table 1 Average recoveries of acetoin from wine sampe at three spike levels

2.6 实际样品的测定

对50瓶葡萄酒样品进行检测，其中市售优质品牌进口葡萄酒及合格国产干红葡萄酒22瓶、干白葡萄酒8瓶、自酿葡萄酒10瓶以及购自广州增槎某批发市场伪劣葡萄酒(经按国标GB/T 15038检测后证实)10瓶，检测结果如表2所示。根据表2的数据可知:①干红葡萄酒中总乙偶姻的含量明显高于干白葡萄酒含量，所测得的优质品牌进口葡萄酒及合格国产干红葡萄酒中乙偶姻含量为1.23～67.40 mg/L，其中干红葡萄酒乙偶姻含量最高达67.40 mg/L，干白葡萄酒的最高含量则为6.40 mg/L;②自酿葡萄酒中颗粒腐败破损的葡萄酿制葡萄酒的总乙偶姻含量显著高于颗粒完整的葡萄酿制的酒样。并且，由于在酿造过程中没有添加SO2，使葡萄酒染上杂菌的几率大为增加，因而自酿葡萄酒中总乙偶姻的含量远高于市售葡萄酒中总乙偶姻的含量;③国产伪劣葡萄酒中乙偶姻含量远高于进口葡萄酒和国产品牌葡萄酒，最高达390.00 mg/L，说明国产伪劣葡萄酒可能使用了较为低劣的原料或者酿造过程污染了杂菌。上述实验结果显示酿酒过程中染菌或原料使用腐败葡萄，均可能导致葡萄酒中总乙偶姻的含量过高。因此，总乙偶姻能作为衡量葡萄酒是否异常发酵的一个指标，可为判断葡萄酒品质提供参考。

表2 样品中总乙偶姻的含量Table 2 Content of total acetoin in wine samples

3 结论

本文建立了一种简单可行的葡萄酒中总乙偶姻的检测方法，乙偶姻经2 4-二硝基苯肼衍生后选用363 nm的检测波长，能排除组分干扰，方法的回收率理想。通过对自酿和市售的国产和进口葡萄酒的检测，说明总乙偶姻含量可以作为鉴证葡萄酒是否异常发酵的一个指标，过高含量的乙偶姻说明葡萄酒酿造过程可能污染了杂菌或使用了腐败的原料。

［1］Chen J C，Chen Q H，Guo Q，Sue R，Ruan S，Ruan H，He G Q，Gu Q.Food Chem.，2010，(122):1247－1252.

［2］He Y N，Wei Y J，Du H J，Tian J J，Pan Q H.Sino－overseas Grapevine and Wine(郝亚楠，魏阳吉，杜慧娟，田娟娟，潘秋红.中外葡萄与葡萄酒)，2008，(3):55－59.

［3］Jiang W G，Li J M，Xu Y，Fan W L，Yu Y.Food Sci.(姜文广，李记明，徐岩，范文来，于英.食品科学)，2011，32(6):225－229.

［4］Chen G，Zhang Q S，Yu W H，Liu Z，You J G.China Brewing(陈功，张其圣，余文华，刘竹，游敬刚.中国酿造)，2010，(12):19－23.

［5］Lian M，Ji X J，Hu N，Du J，Huang H.Chin.J.Anal.Lab.(练敏，纪晓俊，胡南，杜军，黄和.分析试验室)，2008，(27):19－21.

［6］Xu H L，Yu X L，Hu Z Y，Chen H B.Food and Machinery(徐禾礼，余小林，胡卓炎，陈厚彬.食品与机械)，2010，26(2):23－26.

［7］Tian J Y.Food Chem.，2010，123:1318－1321.

［8］Tian J Y，Yu J，Chen X G，Zhang W F.Food Chem.，2009，112(4):1079－1083.

［9］Ken K，Kazutaka K，Tosirou K，Kazuo S.J.Biosci.Bioeng.，2005，99(5):502 －507.

［10］Giuseppe Z，Lorenza C，Vincenzo G.J.Agric.Food.Chem.，2001，49:2722－2726.

［11］Shigehisa U，Yohei I，Naoki K.J.Chromatogr.B，2011，879:1282－1289.

［12］Dong J Z，Serban C M.J.Chromatogr.A，2004，1027:25－35.

［13］Sun M，Liu E D，Song C X，Qin M.Chem.Eng.(孙敏，刘二东，宋春霞，秦梅.化学工程师)，2006，132(9):26－28.

［14］Ma J J，Zhou D Q，Liu S F，Ma H M.Marine Fisheries Research(马敬军，周德庆，柳淑芳，马洪明.海洋水产研究)，2005，26(1):28－31.

［15］Zhu Y M，Cui Q，Wang H Y.Chin.J.Chromatogr.(朱鸭梅，崔群，王海燕.色谱)，2010，28(1):36－40.

［16］Qi X J，Tian X Q，Wang X X.Mod.Instrum.(戚小京，田小青，王欣欣.现代仪器)，2005，(1):23－24.