侯改霞，肖国强

（1.华南师范大学 体育科学学院，广东 广州 510006；2.河南大学 体育学院，河南 开封 475001）

心肌纤维化是糖尿病心肌病变时的重要特征之一[1]。心肌纤维化可增加心室壁的僵硬度，降低心室顺应性而导致心室收缩及舒张功能不全，心功能下降，并最终导致心力衰竭。因此心肌纤维化成为近年来糖尿病心肌病研究领域的一个热点。Castellar等[2]和Searls等[3]分别通过天狼星红染色技术和透射电子显微镜技术观察到运动可显著改善糖尿病大鼠心肌纤维化，但具体机制的研究却很少见。本研究通过高脂喂养加腹腔注射小剂量链脲佐菌素(STZ)构建2型糖尿病大鼠模型，观察运动对2型糖尿病大鼠心肌纤维化的影响，并对其作用机制进行探讨。

1 材料与方法

1.1 造模与分组

雄性SD大鼠45只(SPF级，6周龄，体重(160~180)g；购自郑州大学医学院实验动物中心，许可证号：SCXK(豫)2010-0002)。大鼠分笼饲养，自然昼夜节律变化，自由饮食。室温(23±2) ℃，相对湿度40%~60%。高脂饲料配方：64.8%基础饲料，20%蔗糖，10%猪油，5%蛋黄粉，0.2%胆酸钠(质量比)。高脂饲料由郑州大学医学院实验动物中心配制。

参照Reed等[4]、Srinivasan等[5]方法建立2型糖尿病大鼠模型。SD大鼠普通饲料适应性喂养1周后，随机分成正常对照组(10只)和高脂饮食组(35只)2组，正常对照组继续饲喂普通饲料，高脂饮食组改为高脂饲料喂养。饲喂6周后，高脂饮食组通过口服葡萄糖耐量试验和胰岛素敏感性试验证实产生胰岛素抵抗后，过夜空腹12 h，腹腔注射小剂量链脲佐菌素(STZ，30 mg/kg)，72 h后检测大鼠随机血糖，随机血糖≥16.7 mmol/L为糖尿病大鼠暂时成模标准，剔除血糖不达标大鼠。1周后复查暂时成模大鼠，随机血糖仍≥16.7 mmol/L为建模成功。共有33只大鼠造模成功。将造模成功大鼠随机分为糖尿病对照组(16只)和糖尿病运动组(17只)。

1.2 训练方案

糖尿病运动组大鼠进行不负重游泳训练，水温36℃，训练时间共12周，每周5 d。第1周15 min，以后以每周15 min递增延长，直到延长至每天90 min。大鼠游泳过程中若出现漂浮现象，采用人为驱赶的方式使其继续游泳。

1.3 主要试剂和仪器

STZ购自Sigma公司，兔抗NF-κB P65多克隆抗体、氧化型谷胱甘肽(GSSG)和还原型谷胱甘肽(GSH)检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所，血糖(GLU)、糖化血红蛋白(GHb)、糖化血清蛋白(GSP)、羟脯氨酸(Hyp)、丙二醛(MDA)和Masson染色检测试剂盒购自南京建成生物研究所，晚期糖基化末端产物(AGEs)、胰岛素(INS)酶联免疫检测试剂盒购自上海蓝基生物科技公司。

RT-2100C酶标仪(美国)、RT-1904C半自动生化分析仪(美国)、垂直平板电泳仪(北京市六一仪器厂)、半干印迹转移槽(北京市六一仪器厂)、高速冷冻离心机(Sigma)、722 紫外分光光度计(上海精工仪器有限公司)、MDF-382E(N)超低温冰箱(日本)。

1.4 取材和指标检测

实验过程中，糖尿病对照组和糖尿病运动组大鼠相继死亡9只，至12周游泳训练结束时，糖尿病对照组余13只，糖尿病运动组余11只。在游泳训练第12周周末，所有大鼠过夜禁食12 h后，将大鼠腹腔麻醉，剖腹，从腹主动脉取血，取部分全血用于GHb测定，其余全血3 000 r/min离心20 min，取血清置于-80 ℃冰箱保存待测。取部分左心室置于质量分数为 4%多聚甲醛中固定以备Masson染色检测，另取部分左心室置于-80 ℃冰箱保存以做心肌 AGEs、Hyp、MDA、GSSG和GSH含量和NF-κB P65蛋白Western blotting检测。

1)心肌Masson染色检测。

常规乙醇梯度脱水，石蜡包埋切片，片厚4 μm，Masson染色，中性树脂封片。染色结果：胶原纤维和胞核呈蓝色，胞质、肌纤维呈红色。在Olympus显微镜400倍光镜视野下，每张切片随机选出6个视野并获取图像，采用Image-Pro Plus Version 6.0图像分析系统分析。测量每个视野中蓝色胶原纤维染色的面积，计算胶原面积与心肌组织总面积的比值，取其均值即为每只大鼠胶原容积分数(Collagen Volume Fraction，CVF)，含胶原丰富的冠脉细小血管区域不纳入测量范围内[6]。

2)血液 GLU、GHb、GSP、INS和心肌Hyp、MDA、AGEs、GSSG、GSH检测。

GLU测试采用磷钼酸法，GHb采用比色法(结果以每10 g血红蛋白中糖化血红蛋白的光密度值表示)，GSP采用果糖胺法，羟脯氨酸(Hyp)测定采用碱水解法，MDA采用硫代巴比妥酸法，GSSG和GSH采用分光光度法，Insulin和AGEs采用酶联免疫法，操作检测流程严格按试剂盒说明书进行。心肌组织使用匀浆器进行匀浆，制成10%心肌组织匀浆液。

3)NF-κB P65 Western blot检测。

取大鼠左心室组织100 mg，加入1 000 μL RIPA裂解液(含蛋白酶抑制剂)充分匀浆，4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，取上清，用BCA法进行蛋白定量；取20 μg样品，电泳后转移至 PVDF膜上；5%脱脂奶粉室温封闭1 h；一抗孵育(NF-κB P65一抗稀释浓度为1︰200)，4 ℃过夜孵育；二抗室温摇床孵育2 h。充分洗涤后曝光、显影、定影、扫描，用Quantity One图像分析软件分析目标条带与内参(GAPDH)光密度值的比值。

4)统计学分析。

2 结果及分析

2.1 运动训练对2型糖尿病大鼠血液GLU、INS、GHb和GSP水平的影响

由表1可见，与正常对照组相比，糖尿病对照组血液GLU、INS、GHb和GSP水平均升高(P<0.05或P<0.01)。糖尿病运动组血液GLU、GHb和GSP水平均比糖尿病对照组下降(P<0.01)，但仍高于正常对照组(P<0.01)。

表1 运动训练对2型糖尿病大鼠血液GLU、INS、GHb和GSP水平的影响

表1 运动训练对2型糖尿病大鼠血液GLU、INS、GHb和GSP水平的影响

1)以每10 g血红蛋白中糖化血红蛋白的密度值表示；2)与正常对照组比较，P<0.01；3)与糖尿病对照组比较，P<0.01；4)与正常对照组比较，P<0.05

组别 n/只 c(GLU)/(mmol·L-1) ρ(INS)/(ng·mL-1) GHb1) c(GSP)/(mmol·L-1)正常对照组 10 5.80±0.34 1.46±0.13 11.15±1.47 2.98±0.16糖尿病对照组 13 14.21±0.932) 1.62±0.124) 35.48±3.102) 5.75±0.362)糖尿病运动组 11 10.84±0.512)3) 1.56±0.20 26.34±2.182)3) 4.11±0.352)3)

2.2 运动训练对2型糖尿病大鼠心肌GSSG/GSH值、MDA含量的影响

由表2可见，糖尿病对照组心肌GSSG/GSH、MDA均高于正常对照组(P<0.01)，糖尿病运动组心肌GSSG/GSH、MDA均低于糖尿病对照组(P<0.01)，但仍高于正常对照组(P<0.01或P<0.05)。

表2 运动训练对2型糖尿病大鼠心肌GSSG/GSH值、MDA含量的影响

表2 运动训练对2型糖尿病大鼠心肌GSSG/GSH值、MDA含量的影响

1)与正常对照组比较，P<0.01；2)与糖尿病对照组比较，P<0.01；3)与正常对照组比较，P<0.05

组别 n/只 GSSG/GSH b(MDA)/(nmol·mg-1)正常对照组 10 0.026 7±0.003 9 0.613 3±0.082 4糖尿病对照组 13 0.107 4±0.008 71) 1.185 7±0.078 31)糖尿病运动组 11 0.084 1±0.005 81)2) 0.883 3±0.056 12)3)

2.3 运动训练对2型糖尿病大鼠心肌 AGEs、Hyp和CVF的影响

由表 3可见，糖尿病对照组心肌 AGEs、Hyp和CVF均高于正常对照组(P<0.01)，糖尿病运动组心肌AGEs、Hyp和CVF均低于糖尿病对照组(P<0.01)，但仍高于正常对照组(P<0.01)。

表3 运动训练对2型糖尿病大鼠心肌AGEs、Hyp和CVF的影响

表3 运动训练对2型糖尿病大鼠心肌AGEs、Hyp和CVF的影响

1)与正常对照组比较，P<0.01；2)与糖尿病对照组比较，P<0.01

组别 n/只 w(AGEs)/(ng·mg-1) w(Hyp)/(μg·g-1) CVF/%正常对照组 10 0.36±0.11 477±23 9.16±1.34糖尿病对照组 13 3.32±0.321) 785±421) 19.42±2.191)糖尿病运动组 11 2.00±0.301)2) 654±261)2) 14.90±1.021)2)

2.4 运动训练对2型糖尿病大鼠心肌NF-κB P65蛋白表达的影响

由表4可见，与正常对照组相比，糖尿病对照组大鼠心肌NF-κB P65蛋白表达显著升高(P<0.01)，运动训练可降低糖尿病大鼠心肌NF-κB P65蛋白表达(P<0.05)。

表4 运动训练对2型糖尿病大鼠心肌NF-κB P65蛋白表达的影响

表4 运动训练对2型糖尿病大鼠心肌NF-κB P65蛋白表达的影响

1)与正常对照组比较，P<0.01；2)与糖尿病对照组比较，P<0.05

组别 n/只 NF-κB P65积分光密度比值正常对照组 6 0.147 1±0.032 2糖尿病对照组 6 0.512 5±0.084 31)糖尿病运动组 6 0.431 7±0.057 51)2)

3 讨论

3.1 运动训练对2型糖尿病大鼠血液指标的影响

本研究采用高脂饮食加小剂量STZ复制2型糖尿病动物模型，经过12周的实验周期，2型糖尿病动物模型仍表现出中度高血糖、中度高胰岛素血症和胰岛素抵抗的主要临床特征，证明2型糖尿病大鼠模型建模成功。GHb是血液中血红蛋白与糖类经过缓慢、连续的非酶促反应生成的产物，能反映测定点之前 1~2个月甚至更长时间内的平均血糖水平，是判定糖尿病长期血糖控制的指标[7]。GSP是一类类似果糖胺的物质，是血浆中蛋白质与葡萄糖非酶糖化过程中形成的一种高分子酮胺结构，GSP反映的是测定前1~3周内血糖的平均水平[8]。本研究表明，12周游泳运动不但降低2型糖尿病大鼠血液GLU水平，也显著降低了血液GHb和GSP水平，提示运动降低2型糖尿病大鼠GLU水平的效果是长效稳定的，这可能与运动增加能量的消耗，促进机体对葡糖糖的吸收有关。

3.2 运动训练改善 2型糖尿病大鼠心肌纤维化的可能机制

研究发现，不管是1型糖尿病还是2型糖尿病，糖尿病心肌病最突出的病理组织学变化是心肌纤维化[9]。心肌纤维化是指在心肌的正常组织结构中胶原纤维过量积聚，表现为细胞外基质合成与降解失衡，心脏组织中胶原浓度显著升高或胶原成分发生改变[10]。本研究结果显示2型糖尿病大鼠心肌Hyp和CVF均显著升高，证明2型糖尿病大鼠已经发生了心肌纤维化，而运动对此具有很好的改善作用。

临床药理研究认为糖尿病心肌晚期糖基化终产物(advanced glycosylation end products，AGEs)的含量与心肌纤维化密切相关，对AGEs清除、抑制是防治糖尿病心肌纤维化的重要途径[11]。AGEs通过多种病理机制参与糖尿病组织胶原的代谢，概括起来分为两类：(1)非受体介导途径[12-13]：AGEs直接与长周期蛋白质如胶原蛋白共价交联，同时不易被蛋白酶降解，导致血管壁、心肌变硬和功能改变。(2)受体介导途径[14-15]：AGEs与其受体RAGE (Receptor for AGEs)结合，激活各种信号传导通路，如：MAPK、PI3K、NADPH等，诱导细胞产生氧化应激[16-17]。氧化应激的升高反过来又可激活多条信号传导通路，如ERK1/2MAPK、P38MAPK、JAK/STAT等，进而通过这些信号通路的级联放大反应，激活下游对氧化还原反应敏感的核转录因子NF-κB，NF-κB进一步调节多种基因的表达。本研究显示运动可有效降低2型糖尿病大鼠心肌AGEs含量，这与运动降低正常人体血清[18-19]和肥胖糖尿病 Zucker大鼠肾脏[20]AGEs水平的研究结论一致。运动降低2型糖尿病大鼠心肌AGEs含量，其机制可能是：高血糖是引起AGEs生成的直接因素，运动可显著降低2型糖尿病大鼠血糖水平，进而降低AGEs的生成；其次，AGEs的形成过程产生氧化应激，同时氧化应激也可促进AGEs的形成。运动对糖尿病机体具有抗氧化、抗炎作用[21]，因此可减少AGEs的生成。此外，2型糖尿病大鼠心肌GSSG/GSH、MDA水平显著升高，说明心肌存在氧化应激加剧的现象。运动降低了2型糖尿病大鼠心肌的氧化应激水平，这可能与运动降低AGEs的生成和运动的抗氧化功能有关。

为了验证运动训练降低 2型糖尿病大鼠心肌AGEs、氧化应激与运动改善2型糖尿病大鼠心肌纤维化有关，本研究对大鼠心肌组织NF-κBp65蛋白的表达进行了测试。p50/p65是NF-κB最常见的异源二聚体，细胞静息状态下，NF-κB与其抑制蛋白IκB(Inhibitor of NF-κB，IκB)结合以无活性的形式存在于胞浆中。当细胞受到刺激时(如氧化应激、细胞因子、细菌、病毒等)，蛋白激酶IκB (I kappa B kinase)的活性迅速升高，使抑制蛋白IκB依次发生磷酸化、泛素化和降解，从而使NF-κB以活性形式释放，NF-κB转位入核与靶基因启动子结构域的特定位点结合，发挥转录活性[22]。机体内抗氧化水平降低、氧化应激的增强可升高NF-κB水平[23]，NF-κB的表达水平升高可增强受其调控的多种细胞因子基因表达[24-25]，如 TGFβ、TNF-α、IL-1 β、IL-6 等。通常这些细胞因子可使心肌纤维化、炎症加重、细胞凋亡，心肌功能下降。在本研究中，糖尿病大鼠心肌NF-κB表达较正常对照组显著提高，运动降低了糖尿病大鼠心肌NF-κB的表达水平，从而阻断了NF-κB所诱导的细胞因子表达的反应链。NF-κB是氧化应激的下游分子，同时也是调节RAGE表达的一个启动子，它的激活可作为一种正反馈促进AGEs和RAGE的结合[24]。因此NF-κB蛋白表达水平的降低，也反过来降低了AGEs/RAGE信号通路效应。

总之，运动的降血糖、抗氧化作用降低了2型糖尿病大鼠心肌AGEs含量和氧化应激水平。由于氧化应激水平的降低，使对氧化还原反应敏感的 NF-κB P65蛋白表达下降，并阻断了NF-κB所诱导的细胞因子表达的反应链，直接或间接起到了对心肌组织的保护作用，但是由于其作用机制复杂，具体的信号传导通路有待于进一步的研究。

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