张怡，赵鹏飞，胡怡，贾秀娟，张仲义，章政

线 粒 体 乙 醛 脱 氢 酶 2(aldehyde dehydrogenase,ALDH2)是硝酸甘油(GTN)的有效代谢物一氧化氮(NO)形成的关键酶。自2002年Chen等[1]报道了ALDH2在硝酸甘油的生物活化中起着重要作用，且对ALDH2的抑制可能与引起硝酸甘油的耐药有关，之后研究者们逐渐意识到ALDH2可能在硝酸甘油发挥疗效过程中起着关键作用。如果病人基因中携带有突变的ALDH2的基因Glu504Lys，可以使硝酸甘油在体内的生物转化过程受阻，药物难以有效发挥作用[2]。ALDH2基因多态性到底对硝酸甘油的药物效应产生了何种影响，目前尚无明确的定论。本试验选择450名我院体检中心健康志愿者，测定其舌下含服0.5 mg硝酸甘油前后不同时间点的无创血流动力学指标，观察ALDH2基因多态性对健康受试者硝酸甘油药物效应的影响。

1 对象与方法

对象：选择2011-07至2013-03在青岛大学医学院附属医院体检中心查体的胶东半岛地区汉族健康志愿者450例，男281例，女169例。年龄范围25～65岁，平均年龄(48.46±12.83)岁。受试者排除标准：3年内有心脑血管疾病、内分泌疾病、消化系统疾病、肾脏疾病；曾有心肌梗死病史或行心脏手术者；同时服用其他与硝酸酯类作用相似的药物；临床诊断肥胖；有酗酒史；参加实验前化验有异常；有硝酸甘油服用禁忌症；高血压病患者。在入选本实验研究之前所有志愿者做常规检验包括血常规、血凝常规、生化全套、尿常规等。450名健康志愿者的ALDH2基因型，分为野生型(GG）和突变型(GA/AA)，其中，野生型227例，突变型223例。

试验方案经本院伦理委员会审核批准，所有受试者均自愿签署知情同意书。

试验方法：基因型的测定，采集受试血样2 ml，依地酸（ EDTA）抗凝，使用的血液基因组DNA提取试剂盒购于天根生化科技有限公司；taqman探针检测试剂盒购自美国Life Tech公司。

提取DNA：ALDH2基因单核苷酸多态性位点rs671基因型检测使用美国Life Tech公司taqman探针检测试剂盒(C__11703892_10)进行分型检测，检测流程参照试剂盒使用说明进行；在美国Life Tech公司生产的ABI 9700 PCR仪上开始PCR反应，多聚酶链反应（PCR）条件：95℃ 10 min，(92℃ 15 s, 60℃ 1 min) 60个循环，PCR完成后使用美国应用生物系统公司（ABI）7900HT型荧光定量PCR仪进行数据扫描，检测结果使用相应软件基因型判读。(基因型的测定由上海联合基因公司代测)

无创血流动力学参数的测量（美国Cardio Dynamics公司生产的BioZ.com无创血流动力学检测仪测定）： 受试者于试验当日空腹舌下含服硝酸甘油0.5 mg（规格为每片 0.5 mg，批号为 20110311，北京益民药业有限公司生产），分别在服药前0 min，服药后5 min、15 min时测量受试者的无创血流动力学指标。测量时，受试者取平卧位，按照无创血流动力学监测仪(ICG)的操作说明，由专业医务人员将传感器置于患者两侧颈根部、剑突水平与腋中线交界的胸部两侧，使接触部位充分导电，输入受试者个人信息，包括姓名、性别、年龄、身高、体表面积（BSA）等。待波形稳定后，记录血流动力学指标心排血量（CO）、血管外周阻力（SVR）、收缩压（SBP）、舒张压（DBP），CO取决于心脏前后负荷和心肌收缩力；SVR反应心脏后负荷，反应机体外周血管舒缩状态。

统计学处理：采用Pearson卡方(χ2)检验评价基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡(HWE)。应用SPSS17.0 统计软件包进行统计分析, 计量资料采用均数±标准差表示,两基因型间均数比较采用t检验,多时间点间均数比较采用方差分析，基因型内两两比较采用SNK-q检验，计数资料采Pearson卡方(χ2)检验及卡方趋势检验（饮酒比例），以P＜0. 05具有统计学意义。应用多元线性回归分析多个影响ΔCO、ΔSVR的因素与ALDH2基因多态性之间的线性数量关系。

2 结果

基因多态性的遗传平衡检验：对450位受试者的等位基因、基因型分布进行基因多态性遗传平衡检验，基因型分布符合Hardy-Weinberg 遗传平衡定律 (χ2= 2.156，P＞0.05)，表明样本具有群体代表性。

野生型与突变型一般临床资料的比较：野生型与突变型的样本数、性别、年龄、吸烟、饮酒比例差异无统计学意义 (P均＞0.05)。表1

表1 患者的一般临床资料特征

野生型与突变型无创血流动力学参数CO、SVR、心率、收缩压、舒张压变化的比较：突变型的CO在服 药 前 0 min， 服 药 后 5 min、15 min（CO0min，CO5min，CO15min）三个时间点比较差异有统计学意义

(P=0.025)，其中 CO15min较 CO0min降低显著 (P=0.008)；

野生型的CO在该三个时间点比较差异有统计学意 义 (P=0.019)， 其 中 CO5min较 CO0min升 高 显 著(P=0.005)；突变型的SVR在该三个时间点比较差异无统计学意义 (P=0.404)。野生型的SVR在该三个时间点比较差异有统计学意义 (P＜0.001)，SVR5min及SVR15min较 SVR0min均显著下降，差异有统计学意义(P均＜0.001)。表2

表2 野生型及突变型不同时间点心排血量及血管外周阻力的比较（±s）

表2 野生型及突变型不同时间点心排血量及血管外周阻力的比较（±s）

注：与 CO0 min比 *P＜0.05；与 SVR0 min比△P＜0.05。CO： 心排血量 SVR： 血管外周阻力。余注见表 1

基因型 CO0 min CO5 min CO15 min SVR0 min SVR5 min SVR15 min GA/AA 5.644±1.692 5.333±1.735 5.214±1.729* 1118.909±302.095 1077.81±333.142 1098.76±329.977 GG 5.519±1.152 5.836±1.139* 5.639±1.317 1161.528±282.726 992.096±274.779△ 1091.28±290.670△

突变型的心率、收缩压、舒张压在三个时间点比较差异无统计学意义（P=0.126，0.467，0.083）；野生型的心率、收缩压、舒张压在三个时间点比较差异无统计学意义（P=0.051，0.139，0.070）。

ALDH2基因多态性与ΔCO、ΔSVR的关系（ΔCO1=CO0min-CO5min，ΔSVR1=SVR0min-SVR5min，ΔCO2=CO0min-CO15min，ΔSVR2=SVR0min-SVR15min）：将ΔCO1作为因变量，将ALDH2基因多态性、性别、年龄、体表面积、吸烟史、饮酒史作为自变量，进行多元线性回归分析。选择逐步回归分析，对方程检验，F=168.055，P＜0.001，有统计学意义。对方程中各自变量单独检验，自变量“性别、年龄、体表面积、吸烟史、饮酒史”对因变量的影响不显著，P值分别为：0.773、0.561、0.949、0.969、0.654，均剔除。仅自变量“ALDH2基因多态性”对因变量的影响显著，P值为：0.000，回归方程为：ΔCO1=-0.948+0.631 ALDH2基因多态性。 将 ΔCO2、ΔSVR1、ΔSVR2分别作为因变量，仅自变量“ALDH2基因多态性”对因变量的影响显著，P值均＜0.001，回归方程分别为：ΔCO2=-0.670+0.550 ALDH2基因多态性；ΔSVR1=297.774-128.342 ALDH2基因多态性；ΔSVR2=120.351-50.105 ALDH2 基因多态性。

野生型与突变型无创血流动力学参数CO、SVR变化的组间比较：野生型与突变型在ΔCO1比较、ΔSVR1比较有显著统计学意义(P＜0.001，P＜0.001)；野生型与突变型ΔCO2比较 、ΔSVR2比较亦有显著统计学意义(P＜0.001，P=0.004)。表3

表3 不同基因型 ΔCO 及 ΔSVR 的比较（±s）

表3 不同基因型 ΔCO 及 ΔSVR 的比较（±s）

注：缩略语注解见表2

GG GA/AA t P ΔCO1 -0.317±0.350 0.311±0.643 12.907 ＜0.001 ΔSVR1 169.432±117.415 41.090±135.001 -10.766 ＜0.001 ΔCO2 -0.119±0.043 0.430±0.046 8.786 ＜0.001 ΔSVR2 70.245±12.769 20.139±11.356 -2.929 0.004

3 讨论

硝酸甘油作为抗心绞痛的经典药物，已有多位学者对其生物转化机制进行了广泛研究，2002年Chen等发现在巯基化合物参与下，ALDH2能够催化硝酸甘油生成1，2-二硝酸甘油和亚硝基硫醇，之后ALDH2在硝酸甘油代谢中的重要作用引起越来越多学者的关注。研究发现，ALDH2基因在12号外显子504位点存在一个点突变，出现碱基置换：G-A，因而 ALDH 2 基因存在 ALDH2* 1、ALDH2*2两个等位基因，ALDH2*1/ALDH2*1 基因型(野生型)具有ALDH2的正常活力，ALDH2*1/ALDH2*2基因型(突变型杂合型)存在6%的酶活力，而ALDH2* 2/ALDH2*2基因型(突变型纯合型)则完全丧失酶的活力[3,4]，这对于40% 的有ALDH2基因变异的亚洲人群具有重要的临床意义[5]。

基因的多态性与个体间药物代谢与效应的差异具有相关性。近几年国外动物实验研究提示ALDH2基因在硝酸甘油对肺部及循环系统血管床的生物转化中发挥重要作用[6]，且ALDH2基因的突变可部分减少硝酸甘油的扩血管作用[7,8]。而Isla 等[9]对既往文献报道的回顾，未发现在ALDH2基因高度突变率的日本人群中存在硝酸甘油的临床使用障碍，舌下含服硝酸甘油的药物效应与ALDH2基因多态性的关系临床证据不足。国内研究ALDH2对硝酸甘油代谢的影响多从基因多态性与冠心病患者心绞痛急性发作时单独舌下含服硝酸甘油有效与否的角度着手[4,10]，不同研究结果亦有争议，此外，上述研究中一项重要的衡量指标为疼痛的缓解程度，其界定存在很大的主观感受性，而影响实验结果。

本临床研究应用无创血流动力学检测仪（ICG）评估硝酸甘油的效应，即监测健康人含服硝酸甘油前后无创血流动力学指标CO及SVR的变化评价硝酸甘油的效应，国内外此类研究不多见，而且本研究使用客观的数据指标评估硝酸甘油的效应，克服了上述实验的主观性，为ALDH2基因多态性影响硝酸甘油的药物效应提供了临床证据。ICG是人体阻抗测量技术在心血管血流动力学方面的一个重要应用[11]，根据心脏收缩及舒张时胸腔阻抗的变化,可测得心脏血流动力学状态[12]，ICG的优势有无创、安全、经济、直观，能帮助代偿性与失代偿性心衰患者的诊断、评价冠状动脉病变的严重程度[13]、评估药物治疗的效果和长期预后[14]，本研究根据硝酸甘油药物代谢动力学特点，选取含服硝酸甘油前及服药后5 min、15 min三个具有代表意义的时间点，结合反应心脏每分输出量及外周血管阻力的无创血流动力学指标CO、SVR的变化观察不同基因型受试者含服硝酸甘油的药效差别。实验结果如下，含服硝酸甘油后5 min及15 min较含服硝酸甘油前比较：①野生型 CO均上升，突变型CO均下降。②两种基因型的SVR均下降，野生型下降幅度较大，即ALDH2基因多态性影响反应硝酸甘油效应的CO及SVR的变化。

含服硝酸甘油后 5 min 及 15 min，野生型 CO上升，突变型CO下降的可能解释：①野生型含服硝酸甘油后HR反射性升高明显，而每搏输出量降低相对不明显，据公式CO=SV×HR，二者乘积增大。②突变型含服硝酸甘油后SV降低明显而HR升高相对不明显，二者乘积减小。两种基因型的SVR均下降，野生型下降幅度较大的可能原因：低浓度的硝酸甘油引起的静脉舒张远远大于小动脉的舒张，继而左心室舒张末的压力、外周血管阻力降低，心脏的前后负荷降低，故健康人含服硝酸甘油后外周血管阻力均降低，因野生型具有ALDH2的正常活力，其舒张血管的作用强，所以野生型SVR降低明显。

本实验的不足之处：①仅考虑了ALDH2基因多态性对硝酸甘油代谢的影响，而体外及体内研究提示,硝酸甘油的体内生物转化过程还受以下多种酶的影响，如：谷胱甘肽-S-转移酶，、细胞色素P450还原酶、黄嘌呤氧化还原酶等在内的数种酶，本研究不能剔除其他酶类对硝酸甘油代谢的影响。②本研究属于临床实验性研究，样本量尚不足，且限制在健康人群，下一步拟扩大样本量，纳入冠心病患者，进一步观察ALDH2基因多态性对硝酸甘油效应及治疗效果的影响。

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