翟月

四川大学华西基础医学与法医学院，四川 成都 610041

B细胞非霍奇金氏淋巴瘤是一种发病率较高，但目前治疗效果不理想的肿瘤疾病[1]。紫草素作为紫草有效成分之一，在抗炎、抗微生物及抗肿瘤等作用受到人们关注。其中，紫草素作为抗肿瘤药物，效能高，肿瘤耐药性低[2]。Rajasekar S等人报道紫草素具有抗皮肤癌作用[3]。同时，紫草素可以抑制人类结直肠癌细胞在体内外的生长[4]。另外，紫草素可以通过活性氧物质（reactive oxygen species，ROS）诱导肝癌细胞凋亡[5]。除了可以直接引起肿瘤细胞免疫原性的死亡，紫草素也能够增强基于树突细胞肿瘤疫苗的作用[6]，或是通过诱导活化正常T细胞表达和分泌的调节因子（Regulated on Activation,Normal T cell Expressed and Secreted,RANTES），增强基于基因表达的肿瘤疫苗[7]。然而，紫草素在B细胞非霍奇金淋巴瘤的治疗作用并不明确。本实验以人Raji细胞，即B细胞非霍奇金淋巴瘤细胞作为对象，研究紫草素诱导Raji细胞死亡能力，进一步了解紫草素对B细胞非霍奇金淋巴瘤的抑制作用。

1.方法

1.1 细胞培养

人Burkitt’s 淋巴瘤 Raji细胞系购自美国模式培养物集存库（American type culture collection,ATCC）。Raji细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，置于37℃，5%CO2，饱和湿度培养，每2d换一次液。

1.2 PI染色检测细胞死亡

105个/mL细胞1mL接种于12孔板，分别做对照组（CTL），紫草素组(SHK)，。对照组加入1.0μLDMSO，SHK组加入10μmolL-1紫草素，孵育6h。处理完成的细胞1 000 r/min离心5 min，弃去上清。用4 ℃ 预冷的PBS洗3 次，1 000 r/min 离心5min，去上清，用100 μL结合缓冲液重新悬浮细胞，加入5μL 的碘化丙啶(PI)溶液;混匀后于室温避光孵育15 min;在反应管中加入400 μL PBS，流式细胞仪分析。

1.3 中性红检测细胞存活率

中性红可以被活细胞摄入后累积在溶酶体中，活细胞增多时摄入的中性红量增加，而细胞活性下降或细胞数减少时摄入的中性红会减少。因此，通过将5*105个/mL细胞1mL接种于12孔板，分别加入不同浓度的紫草素（0μmol·L-1，1.25μmol·L-1，2.5μmol·L-1，5μmol·L-1，10μmol·L-1，20μmol·L-1，40μmol·L-1及80μmol·L-1），孵育6h。紫草素诱导后，先用无菌PBS适当溶液洗涤2次，随后600μl细胞培养液重悬细胞，每孔加入60μl中性红染色液,细胞培养箱内孵育2小时。2小时后去除含有中性红染色液的细胞培养液，用PBS洗涤1-2次。加入200微升中性红检测裂解液，室温摇床上裂解10分钟。全波长酶标仪测定样品的A540，690nm作为参考波长[8]。

1.4 统计学分析

采用SPSS进行统计学分析，借助GraphPad Prism5软件进行作图。以上实验均重复三次，实验结果以 ±SD表示.其中统计检验以不同实验组与最对照组分别比较，采用t检验。p<0.05认为具有统计学差异。

2.结果分析

2.1 紫草素诱导Raji细胞死亡

PI单染荧光显微镜分析结果如图1所示，右图加入紫草素的实验组中PI单阳细胞，即死亡细胞数目明显多于左图实验组。由此可得出紫草素能够诱导Raji细胞发生死亡。

图1：紫草素对Raji细胞死亡的影响荧光显微镜下Raji细胞死亡情况，左图为对照组，右图为实验组。

2.2 紫草素诱导Raji细胞死亡呈浓度依赖

紫草素对Raji细胞的生长抑制作用如图3所示。中性红细胞存活率检测（图2）可知，随着药物浓度增大（0μmol·L-1，1.25μmol·L-1，2.5μmol·L-1，5μmol·L-1，10μmol·L-1，20μmol·L-1，40μmol·L-1及80μmol·L-1），紫草素对Raji细胞生长抑制作用逐渐增强。以上实验证明紫草素可诱导Raji细胞死亡，并呈浓度依赖。

图2 不同浓度紫草素对Raji细胞的生长抑制作用

中性红染色检测不同浓度紫草素对细胞生长抑制作用。*表示p<0.05，**表示p<0.01。

3.讨论

紫草素作为一种植物提取物，具有多种生物学功能，尤其是其肿瘤抑制作用受到广泛认可。紫草素抗肿瘤作用与其诱导细胞死亡的能力有关。本实验表明，紫草素可以抑制Raji细胞生长增殖，诱导Raji细胞死亡，并呈浓度依赖。这提示紫草素在非霍奇金B细胞淋巴瘤的治疗中有重要作用。但紫草素治疗肿瘤的机制，尤其是其诱导死亡的类型还有待进一步研究。尽管紫草素对于许多疾病来说是一种治疗作用显著的药物，但其毒性不可忽视，合理规范的使用紫草素十分重要。

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