施 慧，谢建军，许文军，余方平，郭 闯

（1.浙江海洋学院海洋与渔业研究所，浙江省海洋水产研究所，浙江省海水增养殖重点实验室，浙江舟山 316100；2.江苏省水产技术推广站，江苏南京 210036）

对虾病毒病的流行和传播成了养殖业发展的一大困扰，每年因虾病造成的损失非常大对海洋资源的可持续发展造成巨大威胁，因此对虾病毒病的研究已成为当前世界虾病研究领域的热点之一[1]。至今为止，全世界已经在养殖对虾中发现20余种对虾病毒病[1-4]，其中对虾白斑综合症病毒（White spot syndrome virus，WSSV）、传染性皮下组织坏死病毒（Infectious hypodermal&haematopoietic necrosis virus，IHHNV）和桃拉综合症病毒（Taura Syndrome Virus，TSV）是当前严重危害我国对虾养殖业发展的主要对虾病毒[5]。

对虾苗种是养殖生产的基础，没有优良的品种和健壮的苗种，就没有高效的水产养殖生产，虾苗的健康状况和带病与否是影响养殖成败的关键之一。目前浙江省凡纳滨对虾、日本对虾大部分苗种是通过外省调运经过当地苗厂暂养驯化，生产秩序混乱，对虾苗种中病毒的携带及病毒的传播给浙江省的对虾养殖生产带来了安全隐患。本研究通过对2009-2010年在舟山、宁波、三门等市县凡纳滨对虾苗种养殖场调查取样，采用OIE手册[6]推荐的病毒检测方法，对WSSV、IHHNV和TSV这三种我国报道的对虾主要病毒进行普查，旨在了解浙江地区WSSV、IHHNV和TSV在种苗中的流行情况，分析凡纳滨对虾海水养殖中苗种病毒流行的主要特点，全面摸清对虾海水养殖苗种生产情况，提出控制对策，为进一步提高水产苗种质量安全水平，加快水生动物疫病防治站建设，完善水生动物防疫体系奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2009-2010 年从鄞州、慈溪、象山、舟山、三门等地区22家对虾苗种养殖场采集的凡纳滨对虾苗种样品共118份，其中2009年28份，2010年90份。采样参照OIE《水生动物疾病诊断手册》[6]方法，样品置95%乙醇中固定运至实验室4℃，TSV检测用样品置RNA保护剂中，-70℃保存。

1.2 样品前处理

1.2.1 样品总DNA的提取

取已固定虾样，搅动固定瓶中样本，随机取虾样碾碎，取上述匀浆样本约50 mg悬浮于300 μL TE，使用DNA抽提试剂盒（Roche公司）制备检测用DNA样本，-20℃备用。

1.2.2 样品总RNA的提取

取已固定虾样，搅动固定瓶中样本，随机取虾样碾碎，取上述匀浆样本约50 mg，使用天净沙柱式动物RNAout试剂盒制备检测用RNA样本，-70℃备用。

1.3 WSSV、IHHNV和TSV检测引物的合成

WSSV采用KIMURA等[7]的nest-PCR引物，序列如下：

外引物：P1：5’ATCATGGCTGCTTCACAGAC 3’

P2：5’GGCTGGAGAGGACAAGACAT 3’

内引物：P3：5’TCTTCATCAGATGCTACTGC 3’

P4：5’TACGGCAGCTGCTGCACCTTGT 3’

IHHNV采用OIE手册（2009版）推荐的引物，序列如下：

389F：5’CGGAACACAACCCGACTTTA 3’

389R：5’GGCCAAGACCAAAATACGAA 3’

TSV采用OIE手册（2009版）推荐的引物，序列如下:

9195：5 ’-TCA ATG AGA GCT TGG TCC-3’

9992：5 ’-AAG TAG ACA GCC GCG CTT-3’

1.4 WSSV的PCR扩增

PCR扩增仪为美国BioRad DNA Engine PCR仪。25 μL PCR反应体系，第一次PCR：引物为P1和P2，16.25 μL 灭菌双蒸水，2 μL 10×Buffer，2 μL dNTP（2.5 mmol/L each），各 0.5 μL 5 μmol/L 引物，3 μL DNA模板，0.25 μL 5 U/μL Taq DNA聚合酶，混匀后进行PCR反应。第二次PCR：除了引物换成P3和P4外，其它的与第一次PCR相同。

PCR反应条件：第一次反应条件：94℃变性4 min、94℃ 30 s、55℃ 45 s、72℃ 1 min，共39个循环，最后72℃延伸7 min，6℃保存。取5 μL PCR反应液在1.5%琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下观察照相（该反应中特异性的扩增产物是982 bp）。第二次反应条件：94℃变性4 min、94℃ 30 s、50.8℃ 45 s、72℃45 s，共39个循环，最后72℃延伸7 min，6℃保存。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外检测并拍照。（该反应中特异性的扩增产物是570 bp）每次检测反应都设阳性对照（WSSV阳性DNA模板）和阴性对照（无模板和对虾DNA样本）。

1.5 IHHNV的PCR扩增

25 μL PCR 反应体系，包含 16.25 μL 灭菌双蒸水，2 μL 10×Buffer，2 μL dNTP（2.5 mmol/L each），各0.5 μL 5 μmol/L 引物，3 μL DNA 模板，0.25 μL 5 U/μL Taq DNA 聚合酶。PCR 反应条件：94 ℃变性 4 min、94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 1 min，共35个循环，最后72℃延伸7 min，6℃保存。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外检测并拍照。该反应中特异性的扩增产物是389 bp，每次检测反应都设阳性对照（IHHNV阳性DNA模板）和阴性对照（无模板和对虾DNA样本）。

1.6 TSV的RT-PCR扩增

PCR 体系和反应参数如下：I.逆转录反应体系（10 μL）：2 μL 5×RT buffer，1 μL dNTPs （10 mmol/L each），0.5 μL Oligo-dT,0.5 μL RNase inhibitor（40 μ/μL）0.5 μL AMV Reverse TranscriptaseT，RNA 模板 2 μL，3.5 μL RNase free H2O。逆转录反应参数：42 °C 45 min，95 °C 5 min，冰浴5 min。II.PCR反应体系（25 μL）：18 μL 灭菌双蒸水，2.5 μL 10×Buffer，0.5 μL Dntp（10 mmol/L each)，各 0.5 μL 5 μmol/L 引物，2.5 μL cDNA 模板，0.5 μL 5 U/μL Taq DNA 聚合酶。PCR循环参数：94 ℃ 5 min，然后 94 ℃ 45 s、60 ℃ 45 s，共 35循环，最后60℃10 min。（该反应中特异性的扩增产物是213 bp）III。每次PCR检测反应都设阳性对照（TSV阳性cDNA模板）和阴性对照（无模板）。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外检测并拍照。

1.7 跟踪监测

2010年采用PCR检测方法对3个放养舟山某种苗场带毒虾苗的养殖户虾塘进行WSSV的跟踪监测。

2 结果

2.1 苗种样品中WSSV和IHHNV病毒检测结果

从表1可以看出，采集的118份对虾苗种样品中，携带WSSV的有32份，占27.1%：携带IHHNV的有46份，占38.98%；同时携带WSSV和 IHHNV的有 20份，占16.95%，TSV均未见分离（图1、图2）。

图1 对虾苗种WSSV的套式PCR检测结果Fig.1 Deteced the WSSV infection of postlarvae by nested PCR

表1 2009-2010年对虾苗种样品WSSV和IHHNV PCR检测结果Tab.1 Detection of WSSV and IHHNV in Samples by PCR during 2009-2008

2.2 临床跟踪监测结果

2010年8月放养携带WSSV病毒苗种的3个对虾养殖塘陆续发病，并出现大量死亡。病虾壳内侧呈现白色斑点，WSSV PCR检测呈阳性（图 3、图 4）。

3 讨论

本研究通过对鄞州、慈溪、象山、舟山、三门等市县对虾苗种养殖场调查取样，采用OIE手册推荐的病毒检测方法，对WSSV、IHHNV和TSV这3种对虾主要病毒进行调查，结果发现所采集的凡纳滨对虾苗种样品中：27.1%的携带WSSV，38.98%的携带IHHNV，且同时携带此2种病毒的占16.95%，而TSV未见分离。说明浙江地区凡纳滨对虾苗种中有WSSV和IHHNV两种病毒携带，且常存在混合侵染的情况。同时跟踪监测结果显示，放养携带WSSV虾苗养殖塘的WSSV发病率明显高于放养健康苗种的养殖塘，说明携带WSSV的虾苗由于其抗逆性较差极易受外界环境影响而发病。

图2 对虾苗种IHHNV的PCR检测结果Fig.2 Deteced the IHHNV infection of postlarvae by PCR

图3 感染WSSV的凡纳滨对虾Fig.3 P.vannamei infected by WSSV

图4 患病对虾WSSV的PCR检测结果Fig.4 Deteced the WSSV infection of diseased P.vannamei by P CR

对虾白斑综合征于1992年首次发现于中国台湾，此后在世界范围内传播，每年给对虾养殖业造成数百亿元的经济损失，成为威胁对虾养殖业的主要疾病[8]。该病病原是WSSV，其主要的检测方法有：目视观察法、传统组织学方法、电子显微技术、生化检验法、细胞培养方法、免疫学的ELISA技术、分子生物学的核酸探针和PCR技术等[9-14]。PCR特异性高、简单、快速，它不仅在病毒基础生物学研究、病毒间比较研究中广泛应用，而且在检测对虾是否携带病毒等方面也有较高的应用价值，已广泛应用于WSSV检测。一些学者还对PCR技术作了不同的改进，发展出套式PCR、竞争式PCR等方法[15-16]，使检测方法更快速、准确。项目组应用套式PCR方法对采集的苗种样本进行了检测，但在次检测过程中我们发现应用OIE手册推荐的引物对（146F1/146R1、146F2/146R2）检测苗种样本时，59份样只检出1份WSSV阳性，但是应用Kimura的一组引物（P1/P2、P3/P4）检出16份苗种样本呈WSSV核酸阳性，说明该引物组更适于WSSV感染初期或潜伏期的虾苗的检测和环境监测。在本次检测中还发现经一步PCR检测为WSSV阴性的苗种样品，套式PCR的检测结果却为阳性，说明套式PCR检测法较普通的一步PCR有更高的灵敏度，适于WSSV感染初期或潜伏期的亲虾和虾苗的检测和环境监测。战文斌等[17]研究发现海捕亲虾有WSSV感染的阳性个体，由其产的卵培育出的仔虾也检测有WSSV感染的阳性个体，因此存在病毒由亲虾传播给虾苗的感染途径。目前虽然垂直传播尚不明了但亲虾的粪便等排泄物污染了海水,通过海水进行水平传播的可能性非常大，所以苗种养殖场的病毒检测对苗种的质量安全十分必要。

对虾传染性皮下及造血组织坏死病也称慢性矮小残缺综合症，该病是流行于美洲养殖对虾的主要疾病之一，随着我国对虾种苗及亲虾的大量引进，我国部分对虾养殖中已发现IHHNV，且呈流行趋势。LIGHTNER等[18]研究发现，感染IHHNV或患病后存活下来的凡纳滨对虾会终生带毒，并可通过垂直传播把病毒传给下一代和水平传播传给其他种群。本研究中对采集的118份苗种样本进行IHHNV病毒PCR检测，其中阳性比例占38.98%，且有20份样本IHHNV和WSSV均呈阳性，这也说明了浙江地区的养殖对虾苗种受IHHNV危害的严重性，提示有关部门应该加强防范，在虾苗、亲虾的养殖、运输和流通过程中采取有效措施，防止疫病传入。

苗种是水产养殖生产的物质基础，苗种的质量直接影响水产养殖的效益和成败，也是影响养殖产品质量安全的重要因素。浙江省无对虾亲本繁育基地，所有苗种均需外调，然后培育至商品苗规格。调查共采集凡纳滨对虾苗样品118份，其中80%样本来自福建，10%来自海南，10%来自广东。而国内苗种的亲本大部分从国外引进。据不完全统计，2010年国内对虾苗场总共从国外引进亲虾11万对，且进口亲虾中80%以上都购于美国迈阿密SIS凡纳滨对虾育种基地。2010年，华南地区凡纳滨对虾养殖遭受近20年来最严重病害，发病率和排塘率都在50%以上，个别地区高达90%。国内专家经过一系列的调查研究认为今年的病害不是由已知病源引起，有可能是新病原，但发病原因与跟环境、苗种有很大关系。目前要控制对虾病毒病的进一步发展，最有效的方法就是加强对虾种苗的检测工作，不允许把带病毒的虾苗流入到市场中去，同时要大力培育高健康虾苗，从源头上杜绝不良苗种的产生，这样才是预防病毒病的根本所在。

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