李晓明，陶英群，朱廷准，梁国标

半乳糖凝集素-3(Galectin-3，Gal-3)具有识别并结合β-半乳糖苷的特性，因为参与调节肿瘤细胞的粘附、增殖、转化、转移及血管生成等过程，与肿瘤的恶性程度相关［1］，也被称为肿瘤相关蛋白［2］。在不同的肿瘤组织中，Gal-3呈现不同的上调表达，目前，在诸多的癌症如甲状腺肿瘤和乳腺癌、胃肠癌、卵巢癌、淋巴瘤、肺癌及黑色素瘤的患者血清中，已经成为诊断和判断预后的生物指标［3］。已有研究表明，用免疫组化染色和定量染色评分的方法发现，Gal-3在胶质母细胞瘤(Ⅳ级胶质瘤)组织中大量表达［4］，而在低级(Ⅱ级)胶质瘤组织中基本不表达，在间变型(Ⅲ级)胶质瘤组织中处于中间表达，正常脑组织和良性肿瘤中不表达Gal-3蛋白，说明Gal-3的表达与胶质瘤的恶性程度成正相关性［5］。近年来，Gal-3因已成为抗癌药物的靶点而备受关注，已有多种Gal-3抑制剂开发出来作为抗癌药物的先导分子［6］。因此，研究格列卫在肿瘤细胞中的作用机制和与细胞凋亡的关系有重要的理论意义和应用价值。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂 格列卫(Gleevec，酪氨酸激酶抑制剂)为诺华制药有限公司产品;STS(Stauroporine，星形孢菌素-凋亡诱导剂)和溶酶体抑制剂ConA、核染料 Hochest33342、细胞分离液 percoll均为Sigma公司产品;胶质母细胞瘤细胞株U87由本实验室冻存;DMEM培养基为invitrogen公司产品;胎牛血清购自四季青公司;Gal-3鼠单克隆抗体和Lamp2兔多抗均为Santa Cruz Biotechnology产品，β-actin鼠单克隆抗体为Sigma公司产品;山羊抗鼠FITC荧光二抗和山羊抗兔TRITC荧光二抗为中山公司抗体。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 U87细胞株用含10%胎牛血清的 DMEM培养基(含100 IU/mL青霉素，100 mg/mL链霉素)培养，置 37 ℃、5%CO2、湿度95%的恒温培养箱中培养并传代。

1.2.2 细胞免疫染色 先用3.7%多聚甲醛溶液固定细胞，室温孵育15 min，用PBS洗3次，每次5 min。0.1% 的 TritonX-100，室温孵育 5 min后PBS洗3次;然后用1%山羊血清封闭1 h，PBS洗3次;1%山羊血清封闭液配制的一抗孵育1 h后用PBS洗3次;二抗孵育1 h后PBS洗3次;最后用1 μg/mL Hochest33342进行细胞核染色，室温孵育30 min后用PBS洗3次，置激光共聚焦显微镜下观察。

1.2.3 溶酶体提取 所有操作都在4℃进行。用 STE缓冲液［0.25 M 蔗糖，20 mM Tris/HCl(pH 7.2)，5 mM MgCl2］与细胞孵育 20 min，在显微镜下观察细胞膨胀率达90%以上，用Dounce匀浆器将收集的细胞进行匀浆，匀浆后在镜下观察细胞90%以上破碎时，在800 g离心10 min，此时收集的上清称为 PNS(Postnuclear supernatant)。将PNS小心注入装有23%(v/v)percoll离心管中，高速离心，59 000 g离心27 min，可得到分离的溶酶体。

1.2.4 Western blot检测蛋白量 将“1.2.3”步骤中分离得到的溶酶体或者各处理组细胞在不同时间点收取细胞后，分别加入单去污细胞裂解液(50 mmol/L Tris-Cl，150 mmol/L NaCl，0.02% 叠氮钠，1%NP40，复合蛋白酶抑制剂)，裂解物加入5×SDS上样缓冲液在沸水中煮沸5 min，裂解上清经10%SDS-PAGE凝胶电泳，PVDF膜湿转300 mA 60 min，分别与抗 Gal-3抗体和抗 β-actin抗体、抗Lamp2蛋白进行孵育，再与辣根过氧化物酶标记的二抗进行孵育，最后用化学发光试剂显影，凝胶系统成像，Gal-Pro analyzer软件分析条带灰度值，以 Gal-3/β-actin和 Gal-3/Lamp2蛋白表达的条带灰度比值作为Gal-3蛋白的相对表达量。

1.2.5 Sub G1方法检测细胞凋亡率 将各组细胞用0.25%胰蛋白酶消化后，用含血清的培养基终止反应，500 g离心3 min，再用PBS洗细胞，再次离心沉淀细胞。逐滴加入2 mL的70%乙醇(70%乙醇溶于PBS中)，在冰上孵育30 min，重复用PBS洗2次后离心沉淀，加2 mL P-C Buffer(0.2 M NaH2PO4192 mL;0.2 M柠檬酸钠8 mL)，室温孵育30 min。用PBS洗2次后离心沉淀，加入0.3 mL RNase溶液(20 μg/mL，PBS 溶解)，孵育 30 min 后加 3 μL pI溶液(10 mg/mL，PBS溶解)，孵育5 min。用流式细胞仪检测，分析凋亡细胞比率。

2 结果

2.1 格列卫诱导Gal-3进入溶酶体 用5 μM格列卫处理 U87细胞 18 h，对照组 U87细胞用0.1%DMSO(0.1%DMSO是溶解格列卫时的助溶剂)处理相同时间，一抗分别用抗Gal-3抗体、抗Lamp2抗体(溶酶体膜蛋白标记物)，荧光二抗分别用FITC标记Gal-3、TRITC标记Lamp-2进行细胞免疫染色，用Hochest33342标记细胞核，如图1所示，未经处理的U87细胞中，Gal-3主要分布在细胞核，细胞质中也有少量分布，Lamp-2呈现点状分布;用格列卫处理后，Gal-3发生点状聚集并与溶酶体蛋白Lamp-2呈共定位(Merge图中的黄色区域)，说明Gal-3聚集到了溶酶体。

图1 格列卫处理U87细胞株免疫染色结果

为了进一步证明格列卫能够使Gal-3聚集到溶酶体，将U87细胞分成2组，一组使用5 μM 格列卫处理18 h，另一组用0.1%DMSO处理，然后对两组细胞按照溶酶体的提取方法提取溶酶体并进行Western blot检测，如图2所示。以Lamp-2表达量为内参，在没有细胞质污染的情况下，对两组细胞的溶酶体Gal-3/Lamp-2蛋白表达条带灰度值的比值进行比较，格列卫处理组细胞的溶酶体中Gal-3的量是非处理组的6.91倍，说明格列卫诱导Gal-3聚集到溶酶体中。

图2 格列卫处理后U87细胞株溶酶体中Gal-3量的变化

2.2 格列卫使U87细胞中Gal-3蛋白量下降 以β-actin作为内参，对各不同处理组 Gal-3/β-actin蛋白表达条带灰度比值进行比较，如图3所示。用5 μM 格列卫处理U87细胞18 h后，检测细胞内源Gal-3的蛋白量，发现与未处理组细胞相比，Gal-3的蛋白量降低至48.73%，单独使用0.5 μM凋亡诱导剂STS处理时，Gal-3的蛋白量没有显著变化;当5 μM 格列卫和0.5 μM STS同时处理细胞时，Gal-3蛋白量降低至17.88%，说明格列卫和STS同时使用，在促Gal-3蛋白降解方面起到协同的作用;当在上述的各组处理中加入溶酶体特异性抑制剂ConA(10 μM)后，格列卫处理组与未处理组细胞中Gal-3的蛋白量没有显著差异，说明Gal-3通过溶酶体途径发生了蛋白的降解。

图3 格列卫对Gal-3蛋白量的影响

2.3 格列卫促进U87细胞凋亡 将U87细胞分成格列卫(5 μM)处理和不处理2组，处理18 h后，将两组细胞再分成用STS(0.5 μM)处理和不处理2组，处理12 h后，每组设3个重复，用流式细胞仪进行细胞凋亡分析(图4)，结果显示，未处理组U87细胞的凋亡率为0.00% ±0.011%，格列卫处理组细胞的凋亡率为8.94% ±0.034%，STS处理组的细胞凋亡率为28.12% ±0.032%，而格列卫和STS双处理组的细胞凋亡率为51.29%±0.098%。上述结果说明，格列卫能够诱导细胞发生凋亡，并增加肿瘤细胞对凋亡诱导剂的敏感性，当与低剂量的凋亡诱导剂STS共同使用时，会出现协同诱导凋亡的效果。

图4 不同处理的U87细胞株凋亡检测

3 讨论

格列卫作为全球首个获得FDA批准上市的分子靶向抗癌药物，目前作为治疗慢性髓样白血病一线药物和不能手术切除的胃肠道间质肿瘤［7］。这种激酶抑制剂在其他实体肿瘤的应用方面也开展了很多的相关研究，如动物实验证明，格列卫能够有效抑制裸鼠的小细胞肺癌的生长，也能够抑制裸鼠颅内胶质母细胞瘤的生长［8］。但是格列卫抑制实体肿瘤的作用机制尚未阐明。

本研究发现，格列卫处理胶质母细胞瘤U87细胞后，使Gal-3聚集到溶酶体中，并且Gal-3的蛋白量显著降低，用溶酶体特异性抑制剂ConA能够阻止Gal-3蛋白量的降低，说明Gal-3是通过溶酶体途径发生了降解;检测细胞凋亡率发现，格列卫有诱导U87细胞株凋亡的作用，同时格列卫的使用能够使肿瘤细胞对凋亡诱导剂STS作用的敏感性增加，说明格列卫与凋亡诱导剂之间存在协同诱导细胞凋亡的作用。

格列卫作为酪氨酸激酶抑制剂能够促使癌蛋白Gal-3发生溶酶体降解，说明Gal-3是受酪氨酸激酶调控的蛋白，激酶受到阻断剂的抑制后，这种癌蛋白便进入溶酶体发生蛋白的降解，使得细胞更容易受凋亡诱导剂的诱导而发生细胞凋亡，一方面证明了Gal-3在胶质母细胞瘤中起着抗凋亡的作用，另一方面证明Gal-3可以作为该种肿瘤的治疗靶标，这对于以Gal-3为靶标治疗该种肿瘤和研究Gal-3在胶质母细胞瘤中的作用机理研究提供了重要的线索。

［1］Yang RY，Liu FT.Galectins in cell growth and apoptosis［J］.Cell Mol Life Sci，2003，60:267-276.

［2］Dumic J，Dabelic S，Flögel M.Galectin-3:an open-ended story［J］.Biochim Biophys Acta，2006，1760(4):616-635.

［3］Newlaczyl AU，Yu LG.Galectin-3-a jack-of-all-trades in cancer［J］.Cancer Lett，2011，313(2):123-128.

［4］Bresalier RS，Yan PS，Byrd JC，et al.Expression of the endogenous galactose-binding protein galectin-3 correlates with the malignant potential of tumors in the central nervous system［J］.Cancer，1997，80(4):776-787.

［5］李祥龙.半乳糖凝集素-3在颅内肿瘤中的研究进展［J］.国际神经病学神经外科杂志，2011，38(4):389-392.

［6］张文博.半乳糖凝集素-3及其抑制剂的研究进展［J］.中国药学杂志，2009，44(3):165-168.

［7］邓兰，刘鲲，李洁，等.格列卫治疗后bcr/abl融合基因变异的研究［J］.实用医学杂志，2012，28(1):117-119.

［8］余和平，徐晶.抗肿瘤药物—格列卫［J］.世界临床药物，2003，24(8):503-506.