国玉芝，荆洪英，张志国，田 寅

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江佳木斯154003)

引物是所有聚合酶链式反应(Polymerase chain reaetion，PCR)中必须使用的主要材料之一，引物的稳定性对PCR的结果有着重要影响，可以说是决定PCR成败的关键因素，而不同的引物溶解溶液对引物的稳定性有着重要影响，我们在进行CYP1B1432密码子(rs1056836)的PCR中就遇到了该问题。对于引物的稳定性，多数文献[1，2]从引物长度，解链温度(Tm)引物序列，引物二聚体及引物自由能等方面考虑，而没有见到关于引物溶解溶液对于引物稳定性的报道，因而我们使用常用的引物溶解溶液灭菌双蒸水，灭菌去离子水和10mM三羟甲基氨基甲烷－乙二胺四乙酸缓冲液(Tris－EDTA，TE)溶解引物，通过PCR后电泳条带的亮度与脱氧核糖核酸梯状标志(DNA Ladder Marker)亮度的比较确定PCR效果，并将PCR产物进行了电泳和酶切后电泳的方法考察了引物的稳定性，结果表明使用去离子水和TE作为引物的溶解溶液较好，而使用灭菌双蒸水效果较差。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器

S1000 Thermal Cycler PCR仪(美国 Bio－Rad公司);PowerPac Universal通用型电泳仪(美国 Bio－Rad公司);ChemiDoc XRS凝胶成像系统(美国Bio－Rad公司);H2500R－2高速冷冻离心机(上海沪誉贸易有限公司)。

1.1.2 试药

Genomic DNA Purification Kit、Maxima Hot Start Green PCR Master Mix(2X)、Gene Ruler 100 bp DNA Ladder，Oli I内切酶，Fermentas公司生产;Gelred染色剂由BIOTIUM公司生产;CYP1B1432密码子PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;灭菌双蒸水，天津药业集团新郑股份有限公司生产，灭菌去离子水由本院制剂室生产;TE自行配制。

1.2 方法

1.2.1 引物配制及试验方法

参考有关文献[3]使用引物序列为Forward Primer:5＇……ATGCGCTTCTCCAGCTTTGT……3 ＇，Reverse Primer:5 ＇……TATGGAGCACACCTCACCTG……3＇，PCR 产物长度 623bp。取F、R引物各6支，每支1.0 OD，分为3组，每组上下引物各两支，第1组使用灭菌双蒸水(pH6.0);第2组使用灭菌去离子水(pH7.5);第3组使用 TE(pH7.5)溶解配制成100μmol·L－1的引物，置－20℃冰箱保存;次日每组各取1支室温下融化，使用相应的溶解液稀释成10μmol·L－1的引物，每组引物分装为4支，置－20℃冰箱保存，分别于第1～4周的周一开始连续5d进行PCR试验;100μmol·L－1引物分别于第2、第4、第6和第8个月取适量使用相应的溶剂稀释成10μmol·L－1并于每月的第一天连续做5d PCR试验。

1.2.2 PCR、酶切及电泳

PCR体系为Maxima Hot Start Green PCR Master Mix(2X)12.5μL，ddH2O 8.5μL，F、R primer各 1.0μL，血液 DNA 2.0μL。PCR条件为95℃预变性及酶激活4min;95℃变性30s，56℃退火 30s，72℃ 延伸 30s，共 35 个循环;72℃ 末延伸5min。酶切体系为 10 ×green buffer 2μL，Oli I内切酶 1μL，ddH2O 17μL，PCR 产物 10μL;酶切条件:水浴 37℃ 酶切10min，然后取出立即置水浴65℃灭活5min。使用经Gelred染色的2%琼脂糖凝胶电泳45min，电压145V。电泳结束把凝胶从胶板上取出，放到凝胶成像系统中观察结果并拍照。

2 结果

分别取引物按2.1项的时间和2.2 PCR体系与方法进行PCR，100bp DNA Ladder与 PCR产物分别点样5μL，酶切产物点样8μL进行电泳。结果判断:当PCR产物亮度大于或等于600bp Ladder时，判定阳性(+);当亮度小于600bp Ladder或条带显示不清时，判定为阴性(－)(此时酶切后可能会无法显色)。PCR及酶切产物典型电泳图如图1，10μmol·L－1和 100μmol·L－1引物 PCR 产物电泳结果如表1、表2。

图1 CYP1B1432密码子PCR产物及酶切后典型电泳图

表1 10μmol·L－1引物使用时间及PCR产物电泳结果

由表1的结果可见:双蒸水溶解的10μmol·L－1引物第1周可以冻融5次，第2周可以冻融2次;第3周扩增电泳后没有出现PCR产物条带;去离子水和TE溶解的10μmol·L－1引物第1周和第2周可以冻融5次，第3周可以冻融4次，第4周尚可以冻融3次。

表2 100μmol·L－1引物稀释使用时间及PCR产物电泳结果

由表2可见，双蒸水配制的100μmol·L－1引物在－20℃保存两个月时稀释只能冻融2次，到第四个月时使用稀释引物扩增电泳后没有出现PCR产物条带;去离子水和TE溶解的100μmol·L－1引物－20℃可以保存8个月，但在保存8个月时稀释只可以冻融2次。

3 讨论

在“生工生物工程(上海)股份有限公司”(引物合成单位)网站上(http://www.sangon.com/sangon_detail.aspx)如何溶解并保存引物项标注引物溶解使用灭菌双蒸水或10mM TE缓冲液(pH 7.5～8.0)溶解。在实际工作中，溶解引物的溶剂有灭菌双蒸水、灭菌去离子水、TE缓冲液等。本文使用的溶解溶剂经过pH值检测，灭菌双蒸水pH值为6.0，灭菌去离子水和TE缓冲液pH值为7.5。本文试验中表明使用灭菌双蒸水溶解的 10μmol·L－1和 100μmol·L－1引物 PCR效果不好，其原因可能是和其pH值较低有关，引物虽然是小分子单链DNA，但其同样具有DNA的性质，DNA在弱酸性条件下不如在弱碱性条件下稳定，在弱酸性条件下很快降解了，所以PCR效果不如其他两种溶剂溶解的引物PCR效果好。使用灭菌去离子水和TE缓冲液作为溶解液较好，其新溶解的10μmol·L－1引物工作液可以耐受1周内的5次和2周内的5次冻融;在4周和5周时尚可以耐受4次和3次冻融试验，在保存2周后，耐受冻融次数明显减少，所以，10μmol·L－1引物保存时间最好不要超过2周。使用灭菌去离子水和TE配制的100μmol·L－1在－20℃保存4个月时稀释，可以耐受5天内5次冻融，在保存6个月时稀释，尚可耐受4次冻融，保存8个月时稀释，可以耐受2次冻融试验。为保证PCR效果，100μmol·L－1引物保存期以 －20℃6个月为好。由本实验也可以得知，100μmol·L－1引物较 10μmol·L－1引物稳定，在－20℃保存期可以达到6个月。但由于TE缓冲液含有络合剂EDTA，使用时会络合PCR混合液中的Mg2+，其作为引物的溶解液应该严格控制其浓度，以避免影响PCR效果。为了证明引物稳定性试验的可靠性，本文使用保存6个月的引物作了PCR试验并进行酶切，结果三种基因型条带显示清楚，灭菌去离子水和TE配制的引物可以在PCR实践中应用。

[1]李金明.实时荧光PCR技术[M].北京:人民军医出版社，2007，5-7

[2]静国忠.基因工程及分子生物学基础[M].北京:北京大学出版社，1999，195-198

[3]Trubicka J，Grabowska Klujszo E，Suchy J，et al.Variant alleles of the CYP1B1 gene are associated with colorectal cancer susceptibility[J].BMC Cancer，2010，10:420