刘 建，汤德元，曾智勇，罗险峰，李春燕，甘振磊，王 凤，郝 飞

（1．贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳550025；2．贵州省动物疫病预防控制中心，贵州 贵阳550008）

笔者于2011年2月对发生在贵州省某猪场发生的猪繁殖与呼吸综合征病毒和副猪嗜血杆菌混合感染的疫情进行了诊治，结果报告如下。

1 发病情况

2011年2月，贵州某猪场6周龄仔猪共有120头，未免疫猪繁殖与呼吸综合征疫苗，从第1例具有明显症状的仔猪发病1周内，共计有30头仔猪发病，其中死亡5头，发病率25%，死亡率16．7%。发病后猪场曾使用红霉素和链霉素等抗生素进行治疗，病猪体温略有降低，但效果不佳，疫情不断蔓延。

2 临床症状

发病猪表现为精神抑郁，被毛零乱，消瘦，体温升至41℃左右，咳嗽，呕吐，疼痛（尖叫），眼睑水肿，可视黏膜发绀，膝关节肿大，跛行，肌肉震颤，耳朵和两后腿之间腹部皮肤有大量的蓝紫色斑点。

3 剖检病理变化

剖检濒死期仔猪6只，打开胸腔可见大量黄色积液，腹膜和胸膜有浆液性和化脓性纤维素性渗出物，肺部水肿、有针尖大小的出血点，肝脏、脾脏表面覆盖纤维素性渗出物，心肌苍白、变软，心包内有大量淡黄色积液，脾脏稍肿大，边缘有坏死灶，肾呈苍白色或土黄色、变软，剖开后有黄色积液渗出，个别肾脏有出血点，胃黏膜脱落并且有出血点，肠系膜淋巴结和腹股沟淋巴结充血、水肿，用手术刀切开四肢关节可见腔内混有大量絮状物的黄色积液。

4 诊断

4．1 临床诊断

通过对猪场发病情况、临床症状和剖检变化诊断该猪场疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒和副猪嗜血杆菌混合感染。

4．2 实验室诊断

4．2．1 猪繁殖与呼吸综合征的确诊 按照猪繁殖与呼吸综合征病毒RT－PCR检测试剂盒（北京世纪元亨动物防疫技术有限公司生产）说明书处理采集的10份病死仔猪淋巴结、肾脏、脾脏、肺脏和肝脏等病料，然后提取病毒总RNA，进行RT－PCR扩增。RT－PCR反应体系如下：16．8μL RT－PCR 反应液（用前混匀），1．2μL酶混合液，2μL模板RNA，总体积20μL。RT－PCR反应条件：42℃45min，94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环；72℃延伸7min。琼脂糖凝胶电泳后，10份病料均出现了PRRSV阳性条带，大小均为200bp（图1），与预期目的条带大小相符，这说明采集的10份病料中均存在PRRSV，且阳性率为100%，同时设立阴阳性对照。

图1 病料RT－PCR扩增产物电泳结果

4．2．2 副猪嗜血杆菌的确诊

4．2．2．1 细菌分离、培养特性和菌落形态观察 将采集的病料分别接种在含0．05%烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）和5%马血清的TSA培养基、普通琼脂培养基和鲜血琼脂培养基上，37℃恒温培养24～48h，结果该细菌在普通琼脂培养基上不生长；在鲜血琼脂培养基上生长不良；而在TSA培养基生长良好，可见细菌菌落呈露珠状、针尖大小、光滑湿润、淡蓝色，直径约0．5mm左右。取纯培养36h的菌落涂片革兰染色，光学显微镜下观察为革兰阴性细小短杆菌，个别呈两极浓染的球杆状。

4．2．2．2 卫星现象检查 取两个TSA培养基，一个划线接种上述分离菌的单菌落并点种金黄色葡萄球菌，另一个培养基则只划线接种上述分离菌的单菌落作为对照，37℃恒温培养24～48h后，结果发现在葡萄球菌旁边有可疑的副猪嗜血杆菌生长，而且离金黄色葡萄球菌越近菌落越大越多，越远菌落越小且逐渐稀疏，甚至不生长，表现出明显的“卫星现象”。

4．2．2．3 生化特性鉴定 将细菌纯培养物分别接种于葡萄糖、蔗糖、半乳糖、麦芽糖、D－核糖、吲哚、脲酶、D－甘露醇、硫化氢、赖氨酸、氧化酶、靛基质等微量生化反应管，37℃培养24～48h后，可见该分离菌对葡萄糖、蔗糖、半乳糖、麦芽糖、D－核糖反应呈阳性；对其他7种物质反应为阴性。鉴定结果与副猪嗜血杆菌的生化特性相符合［1］。

4．2．2．4 PCR检测 根据副猪嗜血杆菌OMP5基因序列（GenBank登录号：HM172038），用生物软件Premier Primer 5．0 设计1对特异性引物，扩增副猪嗜血杆菌OMP5的全基因，由TaKaRa公司合成。上游引物P1：5′－ATGAAAAAATCTTTAATTGCA－3′；下游引物 P2；5′－TTACATAGAAACTTCTTTTGAACC－3′，预计扩增大小1 113bp。采用裂解法提取DNA，PCR反应条件：94℃3min；94℃30s，57℃30s，72℃1min 30s，共35个循环；72℃5min。PCR产物经1．2%琼脂糖凝胶电泳可见1 113bp的条带（图2），与预期大小相符，说明病料中存在副猪嗜血杆菌。

图2 副猪嗜血杆菌PCR扩增产物电泳结果

4．2．2．5 药物敏感试验 用临床上常用的12种抗生素对分离的副猪嗜血杆菌进行药物敏感性试验，结果该分离的副猪嗜血杆菌对氨苄青霉素、头孢噻吩、阿莫西林、氧氟沙星和环丙沙星高度敏感；对庆大霉素、新霉素和卡那霉素中度敏感；对链霉素、红霉素、洁霉素和四环素耐药。

5 治疗和预防

根据药敏试验结果，采取如下治疗措施：患病猪全部隔离饲养，注射猪繁殖与呼吸综合征病毒高免血清和氨苄青霉素治疗；病死猪及污染物焚烧或深埋，对污染的圈舍和四周环境进行严格消毒；未发病猪则紧急接种猪繁殖与呼吸综合征疫苗，同时加强饲养管理。治疗和药物预防后，病猪病情明显好转，呼吸困难、高热等症状消退，病情得到有效控制。

［1］ 东秀珠．常见细菌系统鉴定手册［M］．北京：科学出版社，2001：125．