焦玉兰，朱秀同，赵玉龙，任 欣，杨保收，梁 武

［瑞普（保定）生物有限公司，河北 保定071000］

目前，禽呼肠孤病毒（REOV）检测方法主要采取PCR检测及血清ELISA检测法。采用PCR检测抗原法，缺少敏感性、特异性试验数据；而血清检测法，由于采集血清，费时费力，且易引起鸡的应激反应，导致鸡只生产性能下降，甚至诱发疾病［1］，且给兽医生物制药厂家的原材料检测造成一定的困难。针对上述问题，农业部兽医局召开了兽医生物制品原材料检测方法研讨会，会议中，与会专家就SPF种蛋检测方法进行了评价［2］，提出了ELISA检测REOV卵黄抗体的新的思路与方法。

卵黄抗体是指鸡、鸭、鹅等蛋禽卵黄中存在的抗体，也称卵黄免疫球蛋白［3］，利用禽呼肠孤病毒具有可垂直传播的特性［4］，以及ELISA检测方法简便、准确、快捷［5］的优势，本试验通过进行ELISA检测卵黄和对应血清中REOV抗体相关性试验 ，以期确定卵黄抗体和血清抗体的对应关系，并依此建立ELISA试剂盒检测卵黄抗体的处理方法及判定标准。

1 材料

1．1 种蛋 150日龄SPF产蛋鸡34只，由山东赛福实验动物有限公司配合完成，血清经ELISA检测REOV抗体阴性，每15d采集血清和收集种蛋1次，做好标记，血清和种蛋编号一一对应，共收集3次。

130日龄普通初产产蛋鸡30只，购自河北保定清苑某养鸡场，血清经ELISA检测REOV抗体阳性，每15d采集血清和收集种蛋，做好标记，血清和种蛋编号一一对应。共收集4次。

1．2 试剂 氯仿（天津市北方天医化学试剂厂）；生理盐水（自配）；REOV－ELISA检测试剂盒（IDEXX公司），批号：BG636；去离子水（自制）。

1．3 仪器设备 酶标分析仪（DNM－9602型），100～1 000μL移液器及枪头，100μL移液器及枪头，0．5～300μL移液器及枪头，2．5μL移液器及枪头，0．5～10μL移液器及枪头，封口膜，2mL离心管，1．5mL离心管，移液槽，低温高速离心机（型号：Sigma），电热恒温水浴锅（型号：DK－98－1型）。

2 试验方法

2．1 种蛋REOV卵黄抗体检测操作方法

2．1．1 样品处理 采用氯仿抽提卵黄抗体方法，300 μL卵黄＋600μL生理盐水＋900μL氯仿，充分振荡后，37℃水浴30min，期间搅拌2～3次，然后4 000r／min离心20min，取上层水相，即为卵黄抗体。

2．1．2 试剂盒操作程序 （一）样品准备：在检测前，用样品稀释液将卵黄抗体作1∶100倍稀释（5μL的样品用样品稀释液稀释到500μL）。每个样品都要换一个吸头。样品加入抗原包被孔之前要充分混合均匀。（二）操作步骤：试剂盒各组分放置至室温（18℃～25℃），颠倒摇动混合均匀。（1）取出包被板，在表上记录样品位置。（2）加100μL不需稀释的阴性对照血清至A1孔和B1孔。（3）加100μL不需稀释的阴性对照血清至C1孔和D1孔。（4）加100μL稀释好的样品至相应的孔内。样品采用双孔检测。（5）在室温（18℃～25℃）孵育30min。（6）吸出所有孔内的液体排到适当的废液缸。（7）用大约300 μL蒸馏水或去离子水洗涤微孔共3～5次，并将孔内液体完全吸干。（8）每孔加入100μL酶标羊抗鸡抗体（HRPO）。（9）在室温（18℃～25℃）孵育30 min。（10）重复步骤（6）和（7）。（11）每孔加入100 μL TMB底物溶液。（12）在室温（18℃～25℃）孵育15min。（13）每孔加入100μL终止液终止反应。（14）空气调零，在650nm，A（650）测量和记录吸光值。

2．1．3 判定标准 只有在阳性对照孔所得的均值减去阴性对照孔所得值的均值（PCX－NCX）必须大于0．075时，阴性对照孔所得值的均值必须小于或等于0．150时，测定结果才有效。样品的S／P值小于或等于0．2，判为阴性。样品的S／P值大于或等于0．2，判为阳性，表示免疫过或感染过REO。

计算：

（1）阴性对照平均值（NCX）＝A1孔 A（650）＋B1孔A（650）／2；（2）阳性对照平均值（PCX）＝C1孔 A（650）＋D1孔 A（650）／2；（3）S／P 值＝样品（650）－NCX／PCX－NCX。

2．2 REOV抗体阴性SPF鸡对应种蛋卵黄直接稀释与氯仿处理样品不同稀释倍数ELISA检测对比

选取经ELISA检测血清REOV抗体阴性的SPF鸡收集的种蛋，采用直接稀释卵黄和氯仿处理卵黄两种方法，对比分析二者与血清检测结果的一致性。直接稀释法采用将卵黄直接进行1∶100、1∶200、1∶400稀释；氯仿抽提卵黄抗体方法［6］为：300μL卵黄＋600μL生理盐水＋900μL氯仿，充分振荡后，37℃水浴30min，期间搅拌2～3次，然后4 000r／min离心20min，取上层水相进行1∶100、1∶200、1∶400稀释作为检品，分别按照ELISA检测试剂盒说明书进行检测，对比分析卵黄样品S／P值与血清S／P值的差异。

2．3 REOV抗体阳性鸡对应种蛋氯仿处理卵黄不同稀释倍数ELISA检测对比 选取经ELISA检测血清REOV抗体阳性种鸡的种蛋，采用氯仿抽提卵黄抗体方法［6］，300μL卵黄＋600μL生理盐水＋900μL氯仿，充分振荡后，37℃水浴30min，期间搅拌2～3次，然后4 000r／min离心20min，取上层水相进行1∶100、1∶200、1∶400稀释作为检品，分别按照ELISA检测试剂盒进行检测，对比分析不同稀释倍数的卵黄样品S／P值与血清S／P值的差异。

2．4 大样本SPF鸡和普通鸡血清和种蛋处理卵黄ELISA检测对比 根据2．2、2．3确定的稀释倍数对SPF鸡和普通鸡采集的血清和种蛋卵黄进行大批量样本检测，对比分析血清与卵黄检测S／P值及REOV抗体判定的符合率。

符合率计算公式：符合率＝（与血清检测结果一致的鸡蛋份数／种蛋检测总数）×100%

3 结果及分析

3．1 REOV抗体阴性SPF鸡种蛋卵黄直接稀释与氯仿处理样品不同稀释倍数ELISA检测结果 选取5份血清REOV抗体阴性的SPF种鸡及对应种蛋，分别采用水稀释法和氯仿抽提法提取卵黄抗体，并做1∶100、1∶200、1∶400的倍比稀释进行ELISA检测，血清根据试剂盒要求做1∶500稀释。检测结果表明，卵黄直接稀释法不同稀释倍数和不同样品之间检测值差异较大。卵黄经氯仿抽提后不同稀释倍数和不同样品的S／P值较稳定，且氯仿抽提卵黄抗体检测法1∶100的稀释度检测结果与血清值最为接近。

3．2 REOV抗体阳性种鸡对应种蛋氯仿处理卵黄不同稀释倍数ELISA检测结果 选取21个阳性血清样本及对应卵黄，卵黄经氯仿处理后做1∶100、1∶200、1∶400稀释，再次进行稀释度试验，检测结果表明，选取的21个阳性种蛋卵黄经氯仿处理后不同稀释度及不同样品的S／P值均较稳定，其中1∶100的稀释度最接近血清值。

综合3．1和3．2结果，确定采用氯仿抽提卵黄抗体方法，抽提后进行1∶100稀释。

3．3 大样本SPF鸡和普通鸡血清和种蛋处理卵黄ELISA检测结果 通过检测定期收集的SPF鸡血清、种蛋及普通鸡血清、种蛋，用上述确定的方法进行大批量样本检测，统计二者差异性，得出二者符合率。

3．3．1 SPF鸡样本检测结果及分析 将随机抽取的103份SPF鸡样本的检测数据，用SPSS 13．0软件进行分析，结果显示，血清和卵黄抗体检测结果差异不显著（P≥0．05）。

3．3．2 普通鸡样本检测结果及分析 将随机抽取103个普通鸡样本的检测数据，用SPSS 13．0软件进行分析，结果显示，血清和卵黄抗体检测结果差异不显著（P≥0．05）。

3．3．3 SPF鸡样本及普通鸡样本检测结果综合分析 见表1。

表1 符合率分析

如表1所示，综合SPF鸡样本及普通鸡样本检测结果，相对于血清ELISA检测法，卵黄ELISA检测法的符合率：阴性符合率为52．91%（109／206）；阳性符合率52．91%（91／206）；总符合率为97．08%［（91＋109）／206］。

4 讨论

REOV是主要经蛋传播疾病之一，世界各地均有发生。有资料证明，养殖场蛋鸡发病率高达90%以上，可引发鸡多种疾病，包括病毒性关节炎／腱鞘炎、矮小综合征、呼吸道疾病、肠道疾病和所谓吸收不良综合征。经济损失常由病毒性关节炎／腱鞘炎和受害鸡增重减少、饲料转换下降等生产性能差引起［7］，给养禽业造成了极大的威胁。若生产疫苗所用种蛋中含有此病毒，很有可能会造成所产疫苗中含有REOV，免疫鸡只后，极易导致鸡只发病，给养禽业带来极大的经济损失。

对于REO疾病的诊断及抗体水平的检测，血清ELISA检测法，由于采血取样过程费时费力，并且，每次采血取样，都会对鸡只产生不同程度的应激反应，导致生产性能下降，甚至诱发疾病。同时，根据REOV具有可垂直传播的特性，若能够掌握血清抗体和卵黄抗体之间的相关性，通过检测卵黄抗体水平，能够掌握血清抗体水平，将会具有重要的临床实践意义。

本试验结果表明，采用REOV－ELISA检测试剂盒检测鸡血清及对应卵黄中的REOV抗体水平，二者具有良好的相关性；相对于血清ELISA检测法，所选鸡样品卵黄ELISA检测法的符合率97．08%，表明可以采用检测血清的REOV－ELISA试剂盒检测卵黄中的REOV抗体水平。采用卵黄做样品，可以避免采血对鸡产生的应激及其连带的经济损失，同时节省了采血所需时间。

［1］ 杨百亮，郭羽．琼扩试验检测鸡传染性法氏囊病卵黄抗体的研究［J］．天津农学院学报，2004，11（4）：27－29．

［2］ 农业部关于SPF蛋检测方法进行评价的复函［Z］．部评审（生）［2011］70号．

［3］ 陈斌，杨志华．鸡卵黄免疫球蛋白（IgY）的作用机理及应用前景［J］．浙江畜牧兽医，2005（1）：9－10．

［4］ 蔡宝祥．家畜传染病学［M］．北京：中国农业出版社，2001：324－325．

［5］ 范祚舟，徐加发，等．酶联免疫分析技术研究发展［J］．分析科学学报，2011，27（1）：113－117．

［6］ 郑立勇，乔彦良，马凤龙，等．卵黄抗体不同提取方法的比较［J］．黑龙江畜牧兽医，2009（1）：106－107．

［7］ 李巨银，胡新岗，魏宁．禽呼肠孤病毒病的研究进展［J］．甘肃畜牧兽医，2011（4）：30－31．