穰 真，崔 凡，李 薇，王有为

(1.四川大学华西医院皮肤性病科，四川 成都 610041;2.四川省医学科学院·四川省人民医院皮肤病性病研究所，四川 成都 610031)

目前已知的11种马拉色菌中，除厚皮马拉色菌外，都属于嗜脂性酵母[1]。Benham于1939年首次发现马拉色菌的生长依赖于培养基中含有的脂类物质[2]。由此，一系列的马拉色菌培养基应运而生，使得马拉色菌的培养和鉴定不再困难。在此基础上关于马拉色菌的致病机制和分型方面的研究得以顺利开展。目前比较常用的马拉色菌培养基有两种，分别为 Leeming＆Notman 培养基[3]和 Dixon 培养基[4]。由于马拉色菌胞壁富含脂类而韧性高，为破壁提取DNA增加了难度。因此，为了保证所提取DNA的数量和质量，实验所用菌量非常重要。目前马拉色菌在传统Leeming＆Notman培养基以及Dixon培养基上的生长条件为35℃，7天。本研究利用马拉色菌对于脂质的依赖性，通过改变Leeming＆Notman培养基中橄榄油和吐温60的含量，摸索出能显著提高马拉色菌培养菌产量的方案，并验证。

1 材料与方法

1.1 马拉色菌培养 传统的Leeming＆Notman培养基配方为：1%蛋白胨、0.5%葡萄糖、0.1%酵母浸膏、0.4%牛胆盐、0.1%甘油、0.05%单硬脂酸甘油酯、0.05%吐温60、1%全脂奶、2%橄榄油、1.2%琼脂、0.5%放线菌酮、0.05%氯霉素。本研究共设3组，每组设 3个样本：第 1组含 1%橄榄油和0.025%吐温60，其余成分含量不变;第2组含2%橄榄油和0.05%吐温60，即标准的Leeming＆Notman培养基;第3组含4%橄榄油和0.1%吐温60。制备上述3种培养基各10ml，倒入小平皿内。取一环球形马拉色菌在1ml灭菌蒸馏水中研磨均匀，用移液器各取5μl含菌悬液滴加入培养基中央，置恒温箱35℃保存。自培养第3、5、7天，每天测量菌落直径并拍照。

1.2 马拉色菌DNA提取及含量分析 在培养第7天，刮取各菌落，用CTAB法提取马拉色菌基因组DNA[5]。将DNA 溶解于50μl纯净水，吸取 10 μl DNA溶液，转移至990μl纯净水，于分光光度计下读取260nm波段的OD值。DNA浓度(mg/m l)=50×(260 nm的OD值)×稀释倍数(本实验为100)。

1.3 扩增马拉色菌ITS1-2区 参照文献[6]设计真菌ITS1和ITS2引物(由上海生物工程有限公司合成)，扩增马拉色菌基因组ITS1-2区。反应体系为 DNA 1 μl、10×buffer 5 μl、Mgcl2(25 mmol/L)3 μl、dNTP(10 mmol/L)1 μl、引物(10μmol/L)各 1 μl、Taq DNA 聚合酶(BBI)2.5 U，用去离子水补足至50μl。反应条件：94℃预变性5 min，94℃ 1 min，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，连续35 个循环，最后72℃延伸10 min。得到的PCR产物于120 V泳动20分钟，经EB染色后凝胶呈像。

1.4 统计学方法 所得数据以均数±标准差表示，使用SPSS 11.0软件进行组间差异性比较，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

培养第3日，4%橄榄油组马拉色菌在Leeming＆Notman培养基上的生长速度和2%橄榄油组差异无统计学意义[(5.83±0.76)mm vs(4.83±0.29)mm，P=0.101]，但在后者的生长速度明显超过1%橄榄油组[(4.83±0.29)mm vs(2.67±0.58)mm，P=0.004]。培养第5日，4%橄榄油组的生长速度显著快于2%橄榄油组[(7.33±0.29)mm vs(6.17±0.29)mm，P=0.008]。随着培养时间的延长，各组之间的差异进一步扩大。第7日，4%橄榄油组的马拉色菌无论是生长速度还是菌落直径都高于另两组(图1)，证明橄榄油含量的增加对马拉色菌的生长有显著促进作用。在培养第7天，生长于含4%橄榄油Leeming＆Notman培养基的马拉色菌DNA浓度显著高于2%橄榄油组[(273.33±24.66)mg/ml vs(205.67±13.32)mg/ml，P=0.014]，而后者亦高于1%橄榄油组[(205.67±13.32)mg/ml vs(118.33±15)mg/ml，P=0.002]，见图 2。该结果提示改良的Leeming＆Notman培养基增加培养菌量，从而直接提高DNA的产出。扩增不同组马拉色菌DNA的ITS1-2区，电泳后可见长度约280 bp片段，同时4%橄榄油组PCR产物的荧光强度明显高于2%橄榄油组和1%橄榄油组(图3)。该结果提示由于含4%橄榄油的培养基增加了马拉色菌DNA产量，其PCR产物的产量也得到相应提高。

图1 球形马拉色菌在含不同浓度橄榄油的Leeming＆Notman培养基上的生长状况 a：培养第3、5、7日的菌落形态;b：培养第3、5、7日的菌落直径

图2 球形马拉色菌在含不同浓度橄榄油的Leeming＆Notman培养基上的DNA产量

图3 球形马拉色菌ITS1-2区电泳结果1：DNA marker;2：阴性对照;3：1%橄榄油组;4：2%橄榄油组;5：4%橄榄油组

3 讨论

马拉色菌是一种嗜脂性的真菌，其生长速度与所处环境的含脂量成正比。这一点也在与马拉色菌相关的疾病中得到证实。马拉色菌所引起的疾病通常好发于皮脂丰富的区域，因为这些区域为马拉色菌的生长提供了必需的脂源[7]。

本研究针对Leeming＆Notman培养基的橄榄油含量设立了3组含有不同脂质比例的培养基，动态观察了菌落的生长状况。实验结果表明4%橄榄油对马拉色菌生长的促进作用是显而易见的。无论是马拉色菌的生长速度还是最终菌落直径都较标准的含2%橄榄油的Leeming＆Notman培养基组和1%橄榄油组高。DNA定量检测证实在相同培养时间内，获得菌量越大，提取的基因组DNA也越多。当前的医学真菌学研究更多地使用各种分子生物学技术对真菌的功能性基因及其编码的生物活性蛋白进行分析。真菌种属的分型鉴定研究也离不开相应的分子生物学技术。因此提供足量、优质的真菌基因组DNA是这些研究的前提。我们扩增了马拉色菌ITS1-2区，进一步证实更多的DNA产出保证了PCR产物的质量。改良的含4%橄榄油的Leeming＆Notman培养基有利于提高马拉色菌科研工作的效率。

本研究的创新之处在于通过将Leeming＆Notman培养基中橄榄油含量增加到4%，加速了马拉色菌的生长速度，缩短了培养周期。我们在增加橄榄油含量的同时，也相应增加吐温60的含量。吐温60是一种乳化剂。增加吐温60的目的是使得培养基中的油相和水相更好的交融，避免出现油含量增多导致的油水分层。而吐温60对球形马拉色菌的生长没有促进作用[8]，所以可以确定马拉色菌的快速生长完全是橄榄油作用的结果。我们也尝试进一步增加橄榄油含量，结果会出现培养基的油相和水相分层，而且马拉色菌生长增快不明显，最重要的是过多的油介入会影响DNA的提取质量。所以经改良含4%橄榄油和0.1%吐温60的Leeming＆Notman培养基是保证马拉色菌生长数量和质量的最佳平衡点。

[1]Midgley G.The lipophilic yeasts:state of the art and prospects[J].Med Mycol，2000，38(Suppl 1):9-16.

[2]Benham RW.The cultural characteristics of Pityrosporum ovale-alipophilic fungus[J].J Investig Dermatol，1939，2:187-203.

[3]van Belkum A，Boekhout T，Bosboom R.Monitoring spread of Malassezia infections in a neonatal intensive care unit by PCR-mediated genetic typing[J].JClin Microbiol，1994，32:2528-2532.

[4]Guillot J，Gueho E，Lesourd M.Identification of Malassezia species:a practical approach[J].JMycol Med，1996，6:103-110.

[5]崔凡，陶诗沁，沈永年，等.马拉色菌临床株分类鉴定的研究[J].中华皮肤科杂志，2005，38(8):492-494.

[6]Aizawa T，Kano R，Nakamura Y，etal.Molecular heterogeneity in clinical isolates ofMalassezia pachydermatis from dogs[J].Veterinary Microbiology，1999，70(1-2):67-75.

[7]Roberts SOB.Pityrosporum orbiculare:incidence and distribution on clinically normal skin[J].Br JDermatol，1969，81:264-269.

[8]Nakabayashi A，Sei Y，Guillot J.Identification of Malassezia species isolated from patientswith seborrhoeic dermatitis，atopic dermatitiss，pityriasis versicolor and normal subjects[J].Medical Mycology，2000，38:337-341.