李欢欢 黄丙仓， 许晓岚 武刚

(1.复旦大学附属中山医院青浦分院放射科，上海 201700，2.上海市浦东新区公利医院医学影像科，上海 200135)

本研究应用氢质子磁共振波谱(1H-magnetic resonance spectroscopy，1H-MRS)观察大鼠右侧大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型经针刺治疗后病灶局部脑代谢物的变化规律，以探讨1H-MRS在评价针刺治疗脑缺血疾病中的实用价值［1］。

1 资料与方法

1.1 主要试剂及设备 手术器械:眼科剪、显微剪、弯剪、眼科弯镊、直镊、止血钳、玻璃分针、动脉夹、大鼠解剖台及固定绳、自制拉钩、圆针、三角针、手术用0号及4号线、华佗牌1.5寸毫针。MCAO栓线(直径为0.26 mm)购自北京沙东生物技术有限公司。碘附消毒液、10%水合氯醛、青霉素溶液为本实验室配制。

1.2 研究方法

1.2.1 MCAO模型的构建 健康雄性SD大鼠60只，由上海中医药大学实验动物中心提供(实验动物质量合格证号:0946490)。标准饮食，自由进水，饲养至体质量250～300 g。采用随机数字表法将其随机分为模型组(n=27)、针刺组(n=27)和假手术组(n=6);再按照磁共振成像(MRI)检查时段将模型组和针刺组分为3个亚组:24 h、3 d、7 d，每个亚组9只。MCAO模型构建:首先，10%水合氯醛腹腔内注射(0.35 mL/100 g)麻醉大鼠，待大鼠处于麻醉状态时，将其仰卧位固定于解剖台上，剪去颈部鼠毛，碘附消毒。取颈部正中线作约2 cm的纵行切口，上至下颌骨平面，下至胸骨柄上缘，玻璃分针分离右侧颈前肌群，显露右侧颈总动脉(common carotid artery，CCA)，并将其与伴行的迷走神经分离，在颈CCA下方穿线备用，提拉穿线向上分离右侧颈外动脉(external carotid artery，ECA)、右侧颈内动脉(internal carotid artery，ICA)，在 ICA分叉处将 ECA结扎，并在ICA远心端下方穿线备用，用两把止血钳提拉备用线两端，交错放置，暂时夹闭ICA，用显微剪在距CCA分叉部4 mm处斜行剪一小切口，用眼科镊顺势将备好的栓线经切口插入，当栓线标记接近ECA和ICA分叉处插入深度约18 mm时，缓慢推线遇阻力停止，将CCA下方的备用线与栓线近心端一并结扎，剪断各结扎线残端，缝合皮肤，切口处滴青霉素溶液2～3滴，腹腔注射2 mL 0.9%氯化钠液，然后将大鼠放回笼中。假手术组手术操作步骤基本同上，只结扎右侧CCA及ECA，不插入线栓。

1.2.2 MRI参数及后处理方法 采用Philips Intera Achieva 1.5T超导MR成像系统，并用EWS影像后处理工作站处理图像，4通道大鼠专用线圈。大鼠麻醉后俯卧位，头置于线圈中央，毛巾覆盖体表保温。行常规横断位SE序列T1WI、T2WI扫描，DWI检查后行 H-MRS。MRS:点分辨自旋回波波谱(point-resolved spectroscopy，PRESS)，刺激回波采集样式(stimulated echo acquisition mode，STEAM)，采用二维多体素波谱分析序列，在T2横断位像上定位，置于大脑中动脉供血区层面(包括梗死区及其周围区)，体素容积为3 mm×3 mm×3 mm，扫描前自动匀场，采集时间为8 min。在右侧梗死区周围选取5～8 mm2感兴趣区，统计该区域的各代谢物波峰下面积。

1.2.3 穴位选取与针刺方法 参照动物穴位定位图谱［2］，选择大鼠百会穴、太阳穴。用10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)腹腔内注射麻醉，待大鼠进入麻醉状态，用1.5寸毫针头穴透刺法(百会透太阳)行针刺，留针30 min，留针期间每隔10 min提插捻转行针1 min，每隔24 h针刺一次。

1.3 统计学处理 采用SPSS 16.0统计软件进行统计学分析，符合正态分布采用两样本t检验，非正态分布采用Wilcoxon非参数检验;两组间比较采用单因素方差分析，多组间比较采用LSD检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 MCAO模型的建立及大鼠偏瘫症状的变化本研究中建立的大鼠MCAO模型左肢均有不同程度的活动障碍。模型组死亡4只，术中死亡1只，24 h内死亡1只，3 d内死亡2只;针刺组死亡3只，24 h内死亡1只，3 d内死亡2只;死亡大鼠24 h MRI检查均见梗死区面积较大。死亡大鼠相应时段数据缺失，其余大鼠可见肢体活动状况随时间延长和针刺治疗得到相应的改善。

2.2 常规T2WI表现 T2WI及对应MRS成像结果见图1。T2WI示，模型组24 h亚组和针刺组24 h亚组大鼠的右侧基底节及额顶叶皮质区信号较对侧镜像区明显增高，局部脑沟回变浅呈现脑肿胀的改变;模型组3 d亚组栓塞区T2WI信号与24 h亚组比较，差异无统计学意义;针刺组3 d亚组栓塞区T2WI信号与24 h亚组比较，差异也无统计学意义，两亚组在造模7 d后栓塞区T2WI高信号范围较24 h亚组和3 d亚组有缩小趋势，假手术组T2WI未见明显异常信号。

2.31H-MRS 检测结果

2.3.1 假手术组 假手术组脑组织MRS波形同正常脑组织磁共振波谱曲线，N-乙酰天门冬氨酸(N-acetyl aspartate，NAA)峰最为明显;肌酸(creatine，Cr)、胆碱复合物(choline，Cho)峰曲线下面积相近;乳酸(lactate，Lac)峰大部分未见，小部分为倒置双峰，波峰下面积明显低于NAA、Cr、Cho。两侧相应部位脑组织代谢物无显著差异(P＞0.05)。

图1 造模后各组常规T2WI表现及MRS成像

2.3.2 模型组及针刺组1H-MRS检测结果 模型组和针刺组的24 h亚组、3 d亚组均见梗死周围区NAA浓度持续下降，7 d亚组NAA浓度有所上升;模型组24 h亚组和针刺组24 h亚组NAA浓度差异无统计学意义(P＞0.5);针刺组3 d亚组和针刺组7 d亚组NAA浓度较模型组明显升高(31.43±2.88比 25.90 ±3.48，60.84 ±2.76 比 54.31 ±1.40;均 P＜0.05)。模型组和针刺组的24 h亚组的Lac浓度差异无统计学意义(P＞0.05);针刺组3 d亚组和针刺组7 d亚组Lac浓度较模型组明显降低(58.82±3.78 比 65.15 ±3.58，50.22 ±4.33比 55.46 ±4.06;均 P ＜0.05)，见图 2、表1。Cho、Cr浓度随着缺血时间延长有不同程度升高，但模型组与针刺组各时段亚组浓度差异无统计学意义(P＞0.05，表2)。

图2 模型组与针刺组各时段亚组NAA与Lac浓度的变化

表1 模型组及针刺组各时段亚组NAA和Lac浓度比较()

表1 模型组及针刺组各时段亚组NAA和Lac浓度比较()

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表2 模型组及针刺组各时段Cho和Cr浓度比较()

表2 模型组及针刺组各时段Cho和Cr浓度比较()

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3 讨 论

MRS是利用磁共振现象和化学位移原理对特定原子核及其化合物进行分析的无损伤性研究活体组织生化代谢的一种技术。不同化合物中相同原子的进动频率不同，故可在MRS频率轴的不同位置形成不同的代谢峰，其峰下面积反映不同化合物浓度，可用积分法进行定量分析。近年来对1H-MRS研究显示［3］，1H-MRS可检测的脑组织的代谢产物主要有 NAA、Lac、Cho和 Cr。NAA 在约2.0 ppm 时发生共振，可以作为反映神经元功能状况的内标物，NAA降低提示神经元和突触的损失及功能异常。Lac在约1.33 ppm处呈倒置双峰，它为糖酵解的最终代谢产物，可反映无氧酵解的情况，正常脑组织磁共振波谱中一般不会有Lac峰。当脑缺血、氧供减少、无氧酵解率增加时，Lac含量亦增加［4］。Cho峰出现于约3.2 ppm处，可反映脑内总胆碱的储藏量，其含量增加可能是细胞合成或分泌量增加的反映。Cr峰见于约3.03 ppm处，是能量代谢的一种产物，通常将Cr作为参照波峰，进行半定量分析。

NAA几乎仅存在于成熟脑组织的神经细胞中，被认为是神经病理状态的生化标志，因脑组织坏死而存活的神经元数量减少会导致NAA降低，但并不是NAA降低的必然因素，因为仅有脑功能失调而无神经元死亡也可引起NAA的显著丢失［5］。Lac是早期缺血的敏感指标，脑缺血早期即可出现Lac峰，Lac峰的出现通常早于NAA峰的下降，但检测到Lac并不预示着一定是梗死，有时非梗死区域也可检测到少量Lac［6］。本研究证明，模型组和针刺组梗死区周围主要代谢产物的总体变化是一致的，均在24 h检测到NAA下降、Lac升高，之后NAA在7 d时回升，Lac在3 d时逐渐回落，但模型组和针刺组在不同时间其主要代谢物在量上有差异，3 d和7 d时针刺组NAA浓度较模型组高，而Lac浓度较模型组低;同时，大鼠的神经功能状态也逐渐好转，7 d时多数大鼠已无明显的肢体运动障碍，而且针刺组的神经功能评分优于模型组，证明针刺对脑梗死的治疗作用是通过促进梗死灶神经元的再生和调节局部代谢实现的。关于Cho和Cr，不同研究得到的结论不同［7］，Gillard 等［8］认为，脑梗死一段时间内，胆碱复合物及肌酸升高，升高的区域多见于梗死的病灶，反映了细胞磷脂膜结构和髓鞘的崩解及能量代谢的异常。Saunders等［9］的临床研究则显示，胆碱复合物在梗死28 h内变化不明显。在亚急性期和慢性期胆碱复合物的浓度升高，且这与梗死灶胶质增生、梗死灶部分修复有关。本研究中模型组与针刺组Cho、Cr浓度在检测的各时段均较假手术组有不同程度升高，但模型组与针刺组之间差异无统计学意义，说明脑梗死后Cho、Cr升高，但针刺的调节作用不明显。假手术组双侧NAA、Cho、Cr无明显变化，部分检测到少量Lac，说明一侧颈总动脉和颈外动脉的结扎对脑缺血代谢物的影响不大，机体可以通过基底动脉环和其他侧支循环的生理性代偿来改善脑缺血的状况。

应用磁共振波谱成像观察大鼠大脑中动脉闭塞针刺治疗效果时，应注意以下几个方面:(1)线栓法的原理是机械式阻塞造成局灶性脑缺血，其发病过程与人群自发的脑梗死有一定差异;(2)针刺组大鼠行针刺均在其麻醉状态下进行，针刺疗效必然会受到麻醉药物的影响;(3)每次针刺的手法力度不同可能会导致结果的差异，因此需保证同一人施针，手法力度保持一致;(4)数据处理中ROI大小均为手动调节，故每次测量存在误差，ROI的选择应避开骨质和血肿等影响磁场均匀性的部位，并尽量减少脑脊液部分容积效应影响和灰白质之间的差异。

［1］ Warlow C P.Epidemiology of stroke［J］.Lancet，1998，352(3):1-4.

［2］ 林文注，王佩.实验针灸学大鼠的常用针灸穴位［M］.上海:上海科学技术出版社，1994:271.

［3］ Sarah JN，Edward G，Andrea P，et al.In vivo molecular imaging for palnning radiation therapy of gliomas:an application of1HMRSI［J］.Journal of Magnetic Resonance Imaging，2006，16(4):464-467.

［4］ Dani KA，An L，Henning EC，et al.Multivoxel MR spectroscopy in acute ischemic stroke comparison to the stroke protocol MRI［J］.Stroke，2012，43(11):2962-2967.

［5］ Demougeot C，Bertrand N，Prigent-Tessier A，et al.Reversible loss of N-Acetyl-Aspartate in rats subjected to long-term focal cerebral ischemia［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2003，23(4):482-489.

［6］ Floor C，Bakker，Catharina JM，et al.Cognitive impairment is related to cerebral lactate in patients with carotid artery occlusion and ipsilateral transient ischemic attacks［J］.Stroke，2003，34(6):1419-1424.

［7］ Muñoz Maniega S，Cvoro V，Armitage PA，et al.Choline and creatine are not reliable denominators for calculating metabolite ratios in acute ischemic stroke［J］.Stroke，2008，39(9):2467-2469.

［8］ Gillard JH，Barker PB，Van Zijl PCM，et al.Proton MR spectroscopy in acute middle cerebral artery stroke［J］.AJNR，1996，17(5):873-886.

［9］ Saunders DE，Howe FA，Boogaart AD，et al.Continuing ischemic damage after acute middle cerebral artery infarction in humans demonstrated by short-echo proton spectroscopy ［J］.Stroke，1995，26(6):1007-1013.