王 超，张 毅，何 平

肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤及肿瘤导致死亡的首要原因［1］。目前，肺癌的治疗方法主要包括化疗、放疗、手术治疗等，但临床疗效不能令人满意，因此，寻找对肺癌更有效的治疗药物尤为重要。近年来，已有多种中药提取物应用于临床抗肿瘤治疗［2］。吉马酮(Germacrone)是中药姜科姜黄属植物莪术根茎的化学成分，主要用于止咳、抗炎、平喘等治疗［3］。近年来，国内学者研究发现，吉马酮具有显著的抗肿瘤作用，可以抑制多种肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡［4-5］，但吉马酮对肺癌的作用尚不明确。本实验观察吉马酮对人肺癌细胞系A549细胞的影响，以期为肺癌的治疗提供新思路和理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料及仪器 人肺癌A549细胞由我院中心实验室惠赠;吉马酮:购自辽宁省药品检验所;RPMI-1640培养基:购自美国Hyclone公司;胎牛血清:购自天津索莱宝生物工程有限公司;二甲基亚枫(DMSO):购自美国Sigma公司;0.25%胰蛋白酶:购自以色列Biological Industries公司;MTT及AnnexinV/PI双染试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司;2.5%戊二醛、1.0%饿酸:中国医科大学电镜室提供;流式细胞仪:美国BD公司。

1.2 细胞培养 用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，在37℃、饱和湿度、5%二氧化碳条件下的培养箱中进行培养。0.25%胰蛋白酶消化传代，选取对数生长期的细胞进行实验。

1.3 MTT法检测细胞增殖 将消化收集好的A549细胞调整成浓度为1×105/mL的细胞悬液，每孔100 μL接种于96孔板，实验设3个平行孔。过夜贴壁后，依次加入不同浓度含吉马酮的培养液，使其终浓度分别为 50、100、200、400 μmol/L，作用24 h。同时设空白对照组以及阴性对照组。每孔加MTT溶液20 μL，继续培养4 h，去上清，每孔加150 μL DMSO，振荡混匀。酶标仪检测(波长570 nm)每孔光密度值(OD值)。实验重复3次。增殖抑制率按如下公式计算:抑制率=(1-加药组OD值/对照组OD值)×100%。

1.4 流式细胞仪AnnexinV/PI双染法检测诱导细胞凋亡 将消化收集好的A549细胞制成浓度为5×105的细胞悬液，接种于6孔板中培养。过夜贴壁后，依次加入不同浓度含吉马酮的培养液，使其终浓度分别为0、100、400 μmol/L 继续培养 24 h。以不含EDTA的胰酶消化收集细胞，离心、洗涤细胞。用500 μL 1×Binding Buffer悬浮细胞，浓度大约为1×106/mL。AnnexinV-FITC、PI双染细胞，避光反应15 min，流式细胞仪检测凋亡率。每组重复3次。

1.5 电子显微镜观察A549细胞形态变化 细胞接种于培养瓶中培养过夜，加入终浓度为400 μmol/L的吉马酮溶液培养24 h，实验同时设空白对照组。培养结束后消化收集细胞，用锥形离心管离心，弃上清，沉淀细胞先后应用2.5%戊二醛、1%锇酸固定，逐级缓慢脱水，包埋，超薄切片，染色，透射电镜下观察并照相。实验重复3次。

1.6 统计学分析 应用SPSS 13.0软件处理数据，组间比较用单因素方差分析(ANOVA)，两组比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT法检测吉马酮对A549细胞增殖的影响MTT法检测结果显示，不同浓度的吉马酮作用于A549细胞24 h后，细胞增殖水平明显受到抑制。随着药物浓度的增大，吉马酮对A549细胞的增殖抑制作用逐渐增加，呈剂量效应关系(P＜0.05)(见图1)。

图1 吉马酮对人肺癌A549细胞增殖的抑制作用

2.2 流式细胞仪AnnexinV/PI双染法测吉马酮诱导A549细胞凋亡 流式细胞仪AnnexinV/PI双染法检测结果显示，吉马酮作用于A549细胞24 h后，随着药物浓度的增大，凋亡细胞的比例逐渐增加，呈现剂量效应关系(见图2)。

图2 流式细胞仪检测吉马酮诱导A549细胞凋亡

2.3 电子显微镜观察A549细胞凋亡的超微结构变化 电子显微镜下观察到吉马酮作用于A549细胞24 h后细胞超微结构的变化，实验组细胞可见染色质浓聚、染色质边集等典型的凋亡改变，而对照组细胞无相应变化(见图3)。

3 讨论

图3 电子显微镜下观察A549细胞的形态学变化(4 000×)

吉马酮是从莪术中提取的天然化合物。从莪术中分离的很多生物成分已被证明有抗肿瘤作用［6］，但对吉马酮的研究较少。Liu 等［4］研究发现，吉马酮可以抑制肝癌细胞系HepG2细胞及Bel7402细胞的增殖，其机制是通过诱导细胞阻滞于G2/M期及促进细胞凋亡，同时研究发现，同一浓度的吉马酮对正常肝脏细胞系L02细胞的抑制作用不明显，表现出高效低毒特点，是理想的抗肿瘤药物筛选对象。Zhong等［5］研究发现，吉马酮可以抑制乳腺癌细胞系MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞的增殖，其机制也与诱导细胞阻滞及促进肿瘤细胞凋亡有关。

本实验以人肺癌细胞系A549细胞为研究对象，MTT结果显示，吉马酮可抑制A549细胞增殖。流式细胞仪AnnexinV/PI双染法检测结果显示，吉马酮可以诱导A549细胞凋亡，并呈现剂量效应关系。电子显微镜观察到了细胞凋亡的形态改变，进一步证实了吉马酮的抑制细胞增殖作用与可诱导其凋亡有关。

综上所述，吉马酮对肺癌A549细胞的增殖有抑制作用，其机制可能与诱导细胞凋亡有关。本实验结果为肺癌的治疗提供了新思路，但尚需进一步深入研究其抗肿瘤机制。

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［1］Cagle PT，Allen TC.Lung cancer genotype-based therapy and predictive biomarkers:present and future［J］.Arch Pathol Lab Med，2012，136(12):1482-1491.

［2］Kaefer CM，Milner JA.The role of herbs and spices in cancer prevention［J］.Nutr Biochem，2008，19(6):347-361.

［3］Claeson P，Panthong A，Tuchinda P，et al.Three non-phenolic diarylheptanoids with anti-inflammatoryactivity from Curcuma xanthorrhiza［J］.Planta Med，1993，59(5):451-454.

［4］Liu Y，Wang W，Fang B，et al.Anti-tumor effect of germacrone on human hepatoma cell lines through inducing G2/M cell cycle arrest and promoting apoptosis［J］.Eur J of Pharmacol，2013，698(1-3):95-102.

［5］Zhong Z，Chen X，Tan W，et al.Germacrone inhibits the proliferation of breast cancer cell lines by inducing cell cycle arrest and promoting apoptosis［J］.Euro J of Pharmacol，2011，667(1-3):50-55.

［6］Li Y，Wo JM，Liu Q，et al.Chemoprotective effects of Curcuma aromatica on esophageal carcinogenesis［J］.Ann Surg Oncol，2009，16(2):515-523.