胡 坚，杨闰平，李恒进，赵 华

解放军总医院 皮肤科，北京 100853

急性光损伤是皮肤对日光中中波紫外线(ultraviolet B，UVB)产生的一种急性炎症反应，正常皮肤在单次过度照射UVB后即可引起这种局部炎症反应。急性光损伤的机制及防治一直是人们普遍关注的问题，研究认为多种细胞因子参与了其发病过程。凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)属于死亡结构域超家族成员，由N端的热蛋白结构域(pyrindomain，PYD)和C端的caspase募集结构域(caspase activation and recruitment domain，CARD)构成，在肺、肝、结肠、卵巢、皮肤、眼、白细胞和淋巴细胞等组织和细胞表达，在先天性和适应性免疫应答、炎症反应、细胞凋亡及调节趋化因子的活性、淋巴细胞的趋化性、抗原的摄取和呈递等方面具有一定的意义[1-2]，而半胱氨酸蛋白酶caspase-1作为ASC的一种常见下游因子参与了ASC引起的多种生理及病理过程[3]。Watanabe和Feldmeyer等发现ASC和caspase-1在UVB照射后的人角质形成细胞中表达增强，提示ASC和caspase-1可能参与了UVB所致急性光损伤的发病过程[4-5]。因此本实验通过观察ASC和caspase-1在UVB诱导的急性光损伤皮损中的表达，探讨其在急性光损伤发病中的可能机制。

材料和方法

1 实验动物 SPF级雌性BALB/c小鼠共30只，6~8周龄，体质量18~20 g。小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司(许可证编号：SCXK(京)2011-0004)，饲养于解放军总医院实验动物中心。

2 试剂和仪器 小鼠ASC、caspase-1单克隆抗体，Abcam公司；UVB灯管(TL20W/12RS)， PHLIPS公司。

3 小鼠急性光损伤模型的建立 辐照计测定UVB灯管波长为280~320 nm，距离灯管20 cm处辐照强度为0.33 mW/cm2。固定照射距离为20 cm，根据辐射时间(s)=所需照射剂量(mJ/cm2)/辐照强度(mW/cm2)确定辐照时间。预实验测定MED：将10只小鼠分为5组，每组2只，参考国内外文献[6-7]，分别对耳部照射30、90、150、300、600 mJ/cm2剂量的UVB，测得MED约为90 mJ/cm2。观察不同剂量UVB照射小鼠耳部临床和组织病理表现，实验组鼠耳采用4倍MED即360 mJ/cm2剂量给予单次照射，表现与急性光损伤的表现一致[8-9]。实验组操作如下：预热UVB灯管5 min，将小鼠固定于工作台上。小鼠随机分为对照组和实验组，每组10只，对照组不照射UVB，实验组照射4倍MED剂量UVB。观察实验组的光损伤变化，于照射后24 h取小鼠耳。

4 免疫组化检测皮肤ASC和caspase-1 分别取实验组和对照组小鼠耳， 4%甲醛固定，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。采用Elivision法，2 μm厚度连续切片，高压锅加热修复，双氧水消除过氧化酶。分别滴加1∶100 ASC和1∶100 caspase-1一抗，4 ℃湿盒过夜后PBS洗3次，每次3 min，滴加二抗，室温静置20 min后PBS洗3次，再加三抗，静置20 min，PBS洗3次。DAB显色，苏木精复染，脱水、透明、中性树胶封片。以PBS代替一抗作阴性对照。

5 结果判定 由两名医生对免疫组化染色切片进行评估。在显微镜下观察表皮细胞着色情况，每张阳性切片随机选取5个高倍视野(×400)，各计数100个角质形成细胞中阳性细胞所占的百分比，根据阳性细胞比例，无阳性染色为0分、0~25%为1分、26%~50%为2分、51%~75%为3分、≥76%为4分；并按染色强度无、弱、中、强分别计为0~3分。综合两个指标将评分分为4级，0分为阴性、1~3分为弱阳性、4~5分为阳性、6~7分为强阳性。

6 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件，两独立样本非正态分布定量资料采用Wilconxon秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

图1 左侧为对照组小鼠，右侧为实验组小鼠Fig.1 Mice in the blank control group (left)and experimental group (right)

图2 小鼠急性光损伤模型(HE×100) 对照组(左)；实验组(右)Fig.2 UVB-induced light injury model in blank control group (left)and experimental group (right)(HE×100)

图3 ASC在小鼠耳部皮肤的表达 对照组(左)；实验组(右)Fig.3 Immunohistochemical staining showing expressions of ASC-like protein in blank control group (left) and experimental group (right)

图4 caspase-1在小鼠耳部皮肤的表达 对照组(左)；实验组(右)Fig.4 Immunohistochemical staining showing expressions of caspase-1 in blank control group(left) and experimental group (right)

结 果

1 小鼠皮肤急性光损伤模型 与对照组相比，4倍MED剂量UVB照射的实验组小鼠24 h后耳部皮肤水肿、增厚，出现红斑、毛细血管扩张。见图1。组织病理改变，HE染色显示表皮细胞增生、水肿、部分细胞空泡形成、核固缩，真皮乳头浅层水肿、血管扩张、管周淋巴细胞浸润。见图2。临床表现和组织病理均符合急性光损伤表现。

2 免疫组化结果 1)ASC在小鼠耳部表皮的表达：对照组小鼠耳部表皮部分细胞胞浆和胞核染为浅棕黄色，染色评分中位数为1.23；照射4倍MED的实验组鼠耳部表皮细胞水肿，排列紊乱，表皮全层细胞胞浆和胞核染为深棕黄色，ASC表达增强，染色评分中位数为4.11，两组间差异有统计学意义 (t=65.0，P＜ 0.01)。见图 3。2)caspase-1在小鼠耳部表皮的表达：对照组小鼠耳部表皮部分细胞胞浆和胞核染为浅棕黄色，染色评分中位数为1.16；照射4倍MED的实验组鼠耳部表皮细胞水肿，排列紊乱，染为棕黄色，且阳性染色细胞增多，caspase-1表达增强，染色评分中位数为1.59，两组间差异有统计学意义(t=56.5，P＜0.01)。见图4。

讨 论

国内外虽不乏关于急性光损伤的研究，但目前尚未形成统一的动物模型，不同模型的差异主要表现在：1)实验动物：国外最多采用SKH-1无毛小鼠，其优点在于皮肤裸露便于照射，且具有胸腺，免疫功能正常[6]。而国内多采用Balb/C小鼠剃毛后照射UVB[7]。2)照射部位：因小鼠背部体表面积较大，实验多对背部进行照射。3)光源：采用日光模拟器或紫外荧光灯，UVB波长约为290~320 nm。4)UVB照射方法：国外SKH-1小鼠多采用UVB单次照射，剂量为 200、360、800 mJ/cm2不等[6]；Sumiyoshi等对C57BL/6J小鼠进行UVB 120 mJ/cm2(约为3.3MED)照射[8]。而国内多对Balb/C小鼠进行180 mJ/cm2单次或多次照射[7]。5)评判标准：以临床表现为红斑、水肿；组织病理表现为表皮细胞水肿、空泡形成、核固缩，表皮内或表皮下水疱形成，真皮血管扩张等为急性光损伤特征[6,8]。本实验采用UVB单次照射Balb/C小鼠，选取毛发较少的耳部皮肤，借鉴国内外经验，并根据测定的MED以及观察剂量的小鼠耳部红斑反应，确定采用4倍MED剂量，临床及组织病理表现与急性光损伤基本符合，认为造模成功。

以往研究认为，UVB引起的急性光损伤主要表现为急性炎症反应和细胞凋亡两个方面。1)急性炎症反应：UVB照射后诱导生成的ROS作为第二信使通过p38MAPK、ERK1/2信号转导通路激活转录因子c-Jun、c-Fos、NF-kB，诱导角质形成细胞生成前炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α，促进角质形成、细胞增殖及中性粒细胞、淋巴细胞等的浸润；UVB还可激活环氧合酶COX-2，进一步诱导合成PGE2、VEGF、MMPs、ICAM-1、PECAM-1等，促进炎症反应及血管生成。2)细胞凋亡：DNA可直接吸收UVB，在相邻嘧啶碱基之间形成二聚体光产物。此外，UVB诱导生成过量的活性氧及氮簇，超过了机体的清除能力，引起多种形式的DNA损伤如单链断裂、链间交联、碱基修饰等。

研究显示，ASC可通过多种途径发挥生物学作用[2-3]：1)参与形成NLRP3炎症小体以参与炎症反应。2)通过寡聚形成超分子结构即焦亡小体调节细胞焦亡。3)参与细胞凋亡过程。在UVB引起的急性光损伤中，一方面低剂量UVB诱导产生大量ROS，并使细胞内Ca2+升高，ROS和Ca2+作为危险因子促使ASC参与形成NALP3炎症小体。ASC作为接头蛋白连接前caspase-1，使caspase-1自分裂、活化，并进一步促使前IL-1β和前IL-18裂解成为活性IL-1β和IL-18，诱导其他炎症细胞因子如IL-6、趋化因子、黏附分子等的合成，放大局部炎症反应[9]。另一方面，UVB也可能通过ROS增强ASC的表达诱导细胞焦亡。焦亡是新近发现的一种新的由caspase-1介导的伴有大量炎症因子释放的细胞程序性死亡方式，ASC寡聚形成超分子功能性复合体通过caspase-1促使DNA的降解，并可导致细胞膜的完整性丧失，从而使胞内容物释放，加重炎症反应[2]。本实验结果显示经4倍MED的UVB照射后，实验组小鼠耳部表皮细胞ASC和caspase-1表达较对照组增强，提示ASC和caspase-1参与了小鼠急性光损伤的发病过程，具体机制有待进一步研究。

1 Hassan H， Amer AO. Cell intrinsic roles of apoptosis-associated speck-like protein in regulating innate and adaptive immune responses［J］. ScientificWorldJournal， 2011， 11 ：2418-2423.

2 de Alba E. Structure and interdomain dynamics of apoptosisassociated speck-like protein containing a CARD （ASC）［J］. J Biol Chem， 2009， 284（47）： 32932-32941.

3 Motani K， Kushiyama H， Imamura R， et al. Caspase-1 protein induces apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain （ASC）-mediated necrosis independently of its catalytic activity［J］. J Biol Chem， 2011， 286（39）： 33963-33972.

4 Feldmeyer L， Keller M， Niklaus G， et al. The inflammasome mediates UVB-induced activation and secretion of interleukin-1beta by keratinocytes［J］. Curr Biol， 2007， 17（13）： 1140-1145.

5 Watanabe H， Gaide O， Pétrilli V， et al. Activation of the IL-1betaprocessing inflammasome is involved in contact hypersensitivity［J］.J Invest Dermatol， 2007， 127（8）： 1956-1963.

6 Svobodová AR， Galandáková A， Sianská J， et al.Acute exposure to solar simulated ultraviolet radiation affects oxidative stress-related biomarkers in skin， liver and blood of hairless mice［J］.Biol Pharm Bull， 2011， 34（4）：471-479.

7 袁李梅， 李杨， 刘流， 等. 绞股蓝皂甙对光损伤小鼠皮肤PCNA表达的影响［J］.昆明医学院学报，2010，31（11）：41-46.

8 Sumiyoshi M， Kimura Y. Effects of olive leaf extract and its main component oleuroepin on acute ultraviolet B irradiation-induced skin changes in C57BL/6J mice［J］. Phytother Res， 2010， 24（7）： 995-1003.

9 Cheng J， Waite AL， Tkaczyk ER， et al. Kinetic properties of ASC protein aggregation in epithelial cells［J］. J Cell Physiol， 2010， 222（3）： 738-747.