何 微，喻 陆，高德禄，张世俊

1南方医科大学研究生学院，广州 510515；2解放军第305医院，北京 100017

非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一类无过量饮酒史和其他明确肝损因素所致的以肝细胞大泡性脂变为主要病理改变的临床综合征[1]。NAFLD自被发现至今，其明确的发病机制仍不完全清楚。现得到普遍认可的是1998年提出的“二次打击"学说[2]。该学说认为胰岛素抵抗和脂质代谢紊乱形成的单纯性脂肪肝是第一次打击，在此基础上各种原因所致的氧化应激(OS)与脂质过氧化(LP)损伤引起的炎症、坏死甚至纤维化、肝硬化则是第二次打击。最新研究已证明，在NAFLD的形成过程中，脂肪组织分泌的脂肪因子，如TNF-α在诱导和加重IR有重要作用[3-4]，参与NAFLD的“二次打击”。脂肪甘油三酯脂酶(adipose triglyceride lipase，ATGL)是新近发现的一种可特异性脂解甘油三酯为甘油二酯的重要脂肪酶。有研究指出，ATGL可表达于肝脏并通过增强甘油三酯水解活性从而减轻脂肪肝[5]，

有学者认为，其有可能为治疗NAFLD提供新的思路。现关于胰岛素抵抗药物治疗NAFLD的报道较多[6-7]，而降脂药物较少。辛伐他汀和非诺贝特是临床上疗效肯定的两种降脂药。因此，本研究以高脂饲料建立NAFLD大鼠模型，采用该两种降脂药物治疗大鼠NAFLD，在其过程中观察血清ATGL酶活性及TNF-α水平的变化以及两者之间的关系，从而进一步寻求NAFLD的可能发病机理及探索新的治疗靶点。

材料和方法

1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠78只，7周龄，体质量210~230 g。实验动物质量合格证明号：SCXK(京)2009-0007(由北京华阜康提供)。

2 高脂饲料配方 10%糖，10%猪油，73.7%普通饲料。该配方根据文献[8]改良，由北京华阜康提供。4 ℃储存。

3 实验仪器和试剂 大鼠血清TNF-α(E02T0008)和ATGL测定试剂盒(E02A0893)购自上海蓝基；Beckman DXC 800全自动生化仪；日本Olympus DP 72显微镜；美国BIO-RAD酶标仪(model 450型)。辛伐他汀片(杭州默沙东)；微粒化非诺贝特(法国利博福尼公司)。

4 实验动物分组及处理 大鼠适应性喂养1周后，分为2组：正常对照组15只，饲以普通维持饲料(北京华阜康提供)；NAFLD组63只，高脂饲料25 g/d，自由饮水。12周末，禁食12 h内眦采血2 ml，检测血脂。处死正常对照组大鼠2只和NAFLD组3只，取肝脏病检证实造模成功后，将余下的NAFLD组大鼠随机分为4组：1)NAFLD对照组15只；2)辛伐他汀组15只，给予辛伐他汀100 mg/(kg·d)灌胃治疗；3)非诺贝特组15只，给予非诺贝特40 mg/(kg·d)灌胃治疗；4)饮食组15只，给予等量0.9%氯化钠注射液；除NAFLD对照组继续饲以高脂饲料，其他3组均改饲普通维持饲料。治疗4周后，下腔静脉取血检测相关指标并处死，提取肝组织病检。

5 检测项目和方法 1)血清FBG、TG、TC、AST、ALT、BUN、Scr在Beckman DXC 800全自动生化仪上测定，采用Beckman原装试剂；2)组织学病检：将新鲜肝组织置于10%甲醛中固定24 h，常规石蜡包埋、切片、苏木精-伊红染色，光镜下观察肝脏脂肪变性和炎症活动情况，每张切片观察5×200个视野；3)酶联免疫吸附试验(ELISA)定量检测大鼠血清中TNF-α和ATGL含量。

6 统计学处理 应用SPSSl3.0软件统计，计量资料以表示。多组间的多个样本均数比较采用One-wayANOVA检验，总体方差齐时，两两组间比较采用LSD法检验；总体方差不齐时，多组间的多个样本均数比较采用Kruskal-Wills检验，两两组间比较采用Dunnett's T3法检验。双变量相关关系分析采用pearson直线相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 体重、肝湿重及肝指数变化 至16周末，与正常对照组相比，NAFLD对照组体重、肝湿重及肝指数均显著升高(P＜0.01)；两药物组及饮食组肝湿重与肝指数均显著低于NAFLD对照组(P＜0.01)；两药物组肝指数显著低于饮食组(P＜0.05)，见表1。

表1 16周末各组大鼠体重、肝湿重及肝指数Tab.1 Body weight, liver wet weight, and liver index in different groups at the end of 16th week(-x±s)

2 血脂血糖及肝肾功水平 16周末，与正常对照组相比，NAFLD对照组血清TG、TC、FBG、ALT、AST、BUN、Scr均显著升高(P＜0.05)；两药物组血清TG、TC、ALT、AST及BUN、Scr均显著低于NAFLD对照组(P＜0.01)；两药物组的肝肾功恢复情况显著优于饮食组(P＜0.05)，见表2。

3 病理学改变 至16周末，正常对照组大鼠肝色鲜红，边缘锐利，光镜下肝小叶结构正常，肝细胞系排列清晰(图1A)；高脂饲料喂养至12周末，NAFLD大鼠肝脏增大，色浅黄，边缘变钝切面油腻感，光镜下肝窦狭窄，肝细胞气球样变，胞浆内充满脂滴，以小泡性脂肪滴为主，伴少量炎细胞浸润和肝细胞坏死(图1 B1)；16周末，NAFLD大鼠肝脏肿胀明显，色泛白，质脆，光镜下重度脂肪变，肝小叶结构不显，肝窦消失，胞浆内大量大泡性脂肪滴将胞核推向一边，有些细胞膜破损，胞核固缩，伴有大量炎性细胞浸润(图1 B2)；经辛伐他汀治疗后，大鼠肝脏接近正常，镜下见少量脂肪变肝细胞，肝窦可见，无明显炎细胞浸润和肝细胞坏死(图1C)；非诺贝特组大鼠肝脏肿胀不显，局部有浅黄，镜下见少中量变性肝细胞，肝窦可见，伴有少量炎细胞浸润，偶见坏死肝细胞(图1D)；饮食组大鼠肝脏较两药物组肿胀，局部浅黄，镜下可见肝细胞中度脂肪变，为小泡性脂肪滴，伴少量炎细胞浸润和坏死肝细胞(图1E)。

4 血清ATGL酶浓度及TNF-α水平 至16周末，与正常对照组相比，NAFLD对照组血清ATGL酶浓度显著降低、TNF-α显著升高(P＜0.01)；相较于NAFLD对照组，两药物组大鼠血清TNF-α显著降低、ATGL酶浓度亦明显升高(P＜0.01)，其中，辛伐他汀组更为显著；饮食组ATGL酶浓度和TNF-α水平虽然有所恢复，但差异无统计学意义 (表 3)。

5 直线相关性分析 直线相关分析结果显示血清ATGL酶浓度与TNF-α呈高度负相关(r=0.948，P＜0.01)，见图2。

表2 16周末各组大鼠相关生化指标Tab.2 Biochemical indications for different groups at the end of 16th week(-x±s)

讨 论

非酒精性脂肪肝病(NAFLD)包括单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎和脂肪性肝硬化三种类型，其中30%的患者可逐渐演变成脂肪性肝硬化[9]。IR是NAFLD发生发展的“初次打击”[2]，是关键环节。近年来研究发现，在NAFLD的形成过程中，由脂肪组织分泌的重要脂肪因子TNF-α，可随血液直接进入肝脏，诱导和加重IR，促使单纯性脂肪肝向脂肪性肝炎和脂肪性肝硬化演变[3-4]。本实验证实了正常肝脏在高脂饮食介导下发展成为脂肪性肝炎的病变过程。模型组大鼠血清TNF-α水平显著著高于正常对照组，也再次证实TNF-α参与了高脂饮食脂肪肝损伤过程[10]。

ATGL是新发现的又一启动脂动员的脂肪分解酶[11-12]，其可特异性脂解甘油三酯，并具有转酰基活性，对基础状态下脂滴大小和甘油三酯储积具有重要调控作用。细胞学水平的研究表明[13]，TNF-α和胰岛素均可明显下调ATGL mRNA表达。本实验数据显示模型组大鼠经长期高脂饮食介导后，血清TNF-α较对照组显著升高，而ATGL酶浓度显著下降，并且两者之间呈高度负相关。因此推测，这可能是由于高TNF-α水平下调ATGL mRNA表达而影响血清ATGL酶浓度水平。而ATGL酶活性降低进而参与了血脂异常和肝细胞脂肪变性过程。

本实验采用临床上疗效肯定的降脂药物辛伐他汀和非诺贝特来治疗NAFLD模型大鼠。结果显示，两药物组大鼠的糖脂紊乱、肝肾功能异常、肝脏增大、脂质沉积以及肝细胞脂肪变性和炎性细胞浸润等均显著减轻，说明这两种药物对大鼠是有效的。有研究发现，他汀类药物与非诺贝特不仅可有效降脂，还有抗炎、抗血栓和改善内皮功能的作用[14-15]。此项实验中的两药物组大鼠血清TNF-α显著降低，证实了两药物均有一定的抗炎作用，这与文献报道结果相似[14,16]，而菲诺贝特较辛伐他汀抗炎效果轻；并且相较于饮食组，两药物组血清TNF-α降低显著，且ATGL酶活性更高。提示两药物能够有效治疗大鼠NAFLD，可能与提高了血清ATGL酶活性有关，而这可能是通过TNF-α的调控来实现的。本研究结果还发现，两药物对大鼠高血脂性肾损害也有一定的治疗作用。

因此，ATGL可能成为治疗NAFLD的又一新的靶点，为治疗NAFLD提供了新的思路。

图2 ATGL 和TNF-α直线相关分析Fig.2 Linear relation of ATGL with TNF-α

表3 16周末各组大鼠血清ATGL 与TNF-α水平Tab.3 Serum ATGL and TNF-αlevels at week 16(-x±s)

1 范建高，曾民德．非酒精性脂肪性肝病的分类及其诊断策略［J］ .中华肝脏病杂志，2003，11（2）：127-128．

2 Christopher PD， Oliver FJ. Steatohepatitis： a tale of two “hits”?［J］.Gastroenterology， 1998， 114（4）： 842-845.

3 Tilg H， Diehl AM. Cytokines in alcoholic and nonalcoholic steatohepatitis［J］. N Engl J Med， 2000， 343（20）：1467-1476.

4 Fantuzzi G. Adipose tissue， adipokines， and inflammation［J］. J Allergy Clin Immunol， 2005， 115（5）：911-919.

5 Reid BN， Ables GP， Otlivanchik OA， et al. Hepatic overexpression of hormone-sensitive lipase and adipose triglyceride lipase promotes fatty acid oxidation， stimulates direct release of free fatty acids， and ameliorates steatosis［J］. J Biol Chem， 2008， 283（19）： 13087-13099.

6 张冬梅，张桂英，王涛，等.罗格列酮和二甲双胍对大鼠非酒精性脂肪肝病的预防及机制研究［J］.中华老年医学杂志，2007，26（1）：51-55.

7 唐勇，宋光耀，杨秀红，等.高脂饮食大鼠脂肪组织甘油三酯脂酶的表达及罗格列酮的干预［J］.中国老年学杂志，2009，29（11）：1349-1351.

8 钟岚，范建高，王国良，等．非酒精性脂肪性肝炎动物模型的建立［J］.中华实用医学，2000，2（1）：3-6．

9 Neuschwander-Tetri BA， Caldwell SH. Nonalcoholic steatohepatitis：summary of an AASLD Single Topic Conference［J］. Hepatology，2003， 37（5）： 1202-1219.

10 敬晓琴，袁喆．高脂诱导的NAFLD大鼠模型血清IL-6、TNF-α等的变化［J］.重庆医科大学学报，2011，36（1）：31-34．

11 Zimmermann R， Strauss JG， Haemmerle G， et al. Fat mobilization in adipose tissue is promoted by adipose triglyceride lipase［J］.Science， 2004， 306（5700）： 1383-1386.

12 Jenkins CM， Mancuso DJ， Yan W， et al. Identification， cloning，expression， and purification of three novel human calciumindependent phospholipase A2 family members possessing triacylglycerol lipase and acylglycerol transacylase activities［J］. J Biol Chem， 2004， 279（47）： 48968-48975.

13 Kralisch S， Klein J， Lossner U， et al. Isoproterenol， TNFalpha， and insulin downregulate adipose triglyceride lipase in 3T3-L1 adipocytes［J］. Mol Cell Endocrinol， 2005， 240（1-2）：43-49.

14 Raina A， Pickering T， Shimbo D. Statin use in heart failure： a cause for concern?［J］. Am Heart J， 2006， 152（1）： 39-49.

15 Elisaf M. Effects of fibrates on serum metabolic parameters［J］.Curr Med Res Opin， 2002， 18（5）： 269-276.

16 Choi KC， Ryu OH， Lee KW， et al. Effect of PPAR-alpha and-gamma agonist on the expression of visfatin， adiponectin， and TNF-alpha in visceral fat of OLETF rats［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2005， 336（3）： 747-753.