王戴 欧阳亮 王文颖

（1.青海师范大学，青海 西宁 810008；2.上海邦成生物科技有限公司，上海 200231）

凝集素是一类具有糖结合专一性、可促使细胞凝集的蛋白质或糖蛋白，广泛存在于动物、植物和微生物中。近十几年来，凝集素的研究、应用方兴未艾[1]。随着灵芝、金针菇和口蘑等食用菌凝集素及其抗肿瘤效果的相继发现，人们逐渐认识到真菌凝集素的重要作用[2-3]。除了含有丰富的维生素，氨基酸，多糖等营养成分外，约有30%～50%的食（药）用菌中都含有具有一定生物学功能的凝集素。

近年来，已发现和研究的食用菌凝集素的数量增长可观，迄今为止全世界仅有大约50多种药用真菌凝集素被纯化[4]，但相对于数量巨大的蘑菇凝集素来说，目前被研究人员已分离纯化和进行性质研究的只是一小部分，仍有很多凝集素有待开发利用。对许多食用菌作用机理也需要进一步深化研究，为其应用提供可靠的科学依据。

本研究采用东北地区常见的5种食用菌：白平菇、吉猴头、灰平菇、鸡腿菇、滑菇子实体筛选凝集素，其结果将对阐明凝集素在大型蕈菌中的分布及其生物学特性提供有意义的基础资料。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株

猴头菌（H.erinaceus）、滑菇(P.nameko)、鸡腿菇(C.comatus)、灰平菇(P.ostreatus)、白平菇（P.lignatilis）、大肠杆菌（E.coli）、金黄色葡萄球菌（S.aureus）、枯草芽孢杆菌（B. subtilis）酿酒酵母菌（S.cererisiae）由齐齐哈尔大学微生物教研室保存。

1.1.2 生化试剂

硫酸铵，聚乙二醇2000，乳糖，D-果糖，D-葡萄糖，蔗糖，阿拉伯糖，麦芽糖，无水碳酸钠，柠檬酸三钠，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，乙二胺四乙酸二钠，牛肉浸膏，蛋白胨，牛血清白蛋白均为国产分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 凝集素的分离和提取

称取烘干的食用菌子实体干品，剪碎后用4倍体积（w/v）0.85%生理盐水4℃浸提24h，用组织捣碎机捣碎成匀浆。按文献[5]的提取方法，得粗凝集素。

1.2.2 2%血细胞样品的制备

取人的A型、B型、AB型、O型血及家兔、鸡、蛤蟆等7种新鲜血以9：1的量加入3.8%的柠檬酸钠，用0.9%的生理盐水反复洗涤2～3次，每次2000rpm离心5min，弃上清，按红细胞体积比配成2%（v/v）的血细胞悬浮液。

1.2.3 红细胞凝集实验

在96孔“V”型血凝板中加入凝集素样品25μL，用PBS（pH7.4）系列倍比稀释；每孔加入25μL 2%血细胞悬液，室温放置2hr后观察凝集结果，有显著凝集现象的最高稀释度孔的稀释倍数，判定为该样品的凝集效价，记录为2n。以PBS（pH7.4）作空白对照。

1.2.4 凝集素热稳定性的测定

参照文献[5]的方法，设置温度为30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃。

1.2.5 pH值对凝集素的凝集活力的影响实验

使用梯度pH缓冲液：pH2.6～7.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液；pH7.38～8.34磷酸氢二钠-磷酸氢二钾缓冲液；pH8.6～10.0甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。

在96孔V型血凝板上加45μL凝集素溶液与等体积的缓冲液进行倍比稀释后，加入等体积的2%的红细胞悬液，振匀。室温下放置1hr后用显微镜进行检测。以缓冲液作空白对照。

1.2.6 糖抑制实验

实验用6种糖分别为乳糖（Lactose）、D-果糖（D-Fructose）、D-葡萄糖（D-Glucose）、蔗糖（Sucrose）、阿拉伯糖（Arabinose）、麦芽糖（Maltose），浓度均为2.5mg/mL。参照文献[5]的方法，以糖液作空白对照。

1.2.7 金属离子对凝集素的凝集活力的研究

取45μL样品置于“V”型血凝板中并加入20mmol/L的EDTA，用2%（v/v）兔血细胞测定其凝集活力，对照样不加EDTA。对于受EDTA抑制的凝集素分别补加0.01mol/L金属离子（Fe3+、Mn2+、Cu2+、Zn2+、Ca2+、Mg2+、K+）溶液后，观察是否恢复凝集活性。

2 实验结果

2.1 血凝集活力

肉眼观察，无凝集现象的红细胞沉积在V型板呈大红点，而有凝集现象时呈网状且不下沉（见图1）。

图1 蕈菌对兔血细胞的凝集结果

以能发生凝聚作用的最低样品浓度来表示各凝集素的效价, 对兔红细胞的凝集活性，猴头菌、白平菇、灰平菇、鸡腿菇分别为滑菇对6种红细胞均没有活性。

2.2 温度对凝集素凝集活力的影响

4种蕈菌粗蛋白在-20℃、4℃下放置近一个月，对兔红细胞的凝集性仍然未变。但除鸡腿菇外，对高温处理的耐受性不如对碱性环境的耐受能力。

表1 温度对蕈菌凝集素凝集活性的影响

2.3 酸碱度对凝集素凝集活力的影响

除鸡腿蘑在pH≥10.0时失去凝集活力外，其余三种蕈菌都对碱性条件显示了较强的耐受性，但四种蕈菌普遍对酸性环境缺乏耐受性。

2.4 糖抑制实验结果

白平菇、鸡腿蘑对兔血细胞的凝集不被供试的6种糖抑制；猴头菇被除乳糖和蔗糖以外的4种糖所抑制；灰平菇则可被阿拉伯糖和麦芽糖外所抑制，结果见表2。

表2 不同糖对蕈菌凝集素凝集活性的影响

2.5 金属离子对凝集活力的影响

20mmol/L EDTA作用之后，4种蕈菌中仅鸡腿蘑凝集素不能被金属螯合剂EDTA所抑制。猴头菇在添加Mn2+、Cu2+、Zn2+这三种离子后恢复了凝集活力；白平菇在添加Mn2+、Cu2+、Zn2+、Ca2+这四种离子后恢复了凝集活力；灰平菇在添加Mn2+、Cu2+离子后恢复了凝集活力。

3 讨论

根据本实验观测可知，滑菇中不含凝集素；猴头菌、白平菇、灰平菇、鸡腿菇对兔血细胞均有凝集作用，凝集活性由强到弱依次为鸡腿菇凝集素>灰平菇凝集素>猴头菇凝集素>白平菇凝集素。

4种凝集素都在30℃表现出最大凝集活性，这与其菌丝体生长的平均温度较一致。鸡腿菇是一种典型的中温性土生菌，而其凝集素能够耐受80℃高温，推测可能原因在于1、鸡腿菇凝集素活性位点主要为糖链，相对于肽链和蛋白质对热更不敏感；2、多肽中含有较多二硫键；3、这种蕈菌中含有多种大分子凝集活性物质。刘艳如[6]在对鸡腿菇、平菇凝集素耐热性研究中发现，两类凝集素粗提物的最高耐受温度分别为60℃、40℃，而本研究检测到的最高温度分别是80℃、50℃。这与食用菌样品来源有密切关系。

4种蕈菌在pH7.0～8.5之间表现出较强的凝集活性，这可能与蕈菌多为土生菌，生长环境中性偏碱有关，是一种适应性反应。白平菇、鸡腿蘑凝集素可以和全部6种糖结合，推测这两种蕈菌中可能含有结构、成分各不相同的多种凝集物质。

关于这几种凝集素的成分、结构、化学性质及其它生物学活性，有待于作进一步研究。

[1]舒晓燕,阮期平,侯大斌.植物凝集素的研究进展[J].现代中药研究与实践,2006,20(6)：53-56.

[2]PatrickHK,Ngai,NgTB.Amushroom(Ganoderma capense)lectinwithspectacularthermostability,potentmitogenic activityonsplenocytes,andantiproliferativeactivitytowardtumor cells[J].BiochemBiophysResCommun,2004,314(4)：988-993.

[3]WangH,NgTB.Isolationandcharacterizationofvelutin,anovellowmolecularweightribosomeinactivatingproteinfrom wintermushroom(Flammulinavelutipes)fruitingbodies[J].Life Sci,2001,68(18)：2151-2158.

[4]吴恩奇,图力古尔.蘑菇凝集素及其研究进展[J].菌物研究,2006,4(4)：69-76.

[5]王庆忠,张鹭,欧阳亮.14种蔬菜中凝集素的提取和生物活性研究[J].中国热带医学,2008,8(5)：749-783.

[6]刘艳如,余萍,郑怡.12种食用菌凝集素的筛选[J].福建师范大学学报(自然科学版),2003,19(2)：65-68.