刘 曦，祝连彩，王伯初

（重庆大学生物工程学院，生物流变科学与技术教育部重点实验室，重庆400044）

人体在新陈代谢过程中会产生大量的活性氧（ROS）[1]，包括超氧阴离子自由基（O2-·）、羟自由基（·OH）、脂氧自由基等自由基和过氧化氢（H2O2）等非自由基基团，它们具有强氧化性，会严重损害机体的组织和细胞[2]，是很多疾病如动脉粥样硬化、心血管疾病、大脑功能障碍和风湿病等产生的重要原因[3]。大量文献报道，很多中草药、水果、蔬菜具有抗氧化活性，并且从这些食用及药用植物中寻找低毒、安全、有效的天然抗氧化剂已成为抗氧化剂发展的必然趋势[4-6]。蓝莓，又称越橘、蓝浆果，属杜鹃花科（Ericaceae）越橘属（Vaccinium）多年生落叶或常绿灌木。蓝莓果实中有大量的黄酮、多酚、花青素等活性物质，且有较高的抗氧化活性[7]，但其昂贵的价格极大的限制了蓝莓的广泛应用，进而人们把注意力转移到蓝莓叶上。有报道蓝莓叶中含有总酚、原花青素等[8]。此外，蓝莓叶提取物有降血糖[9]、降血脂[10]、预防癌症[11]等药理作用，因此有必要对蓝莓叶进行研究以考察其在食品、药品等方面的应用潜力。对蓝莓叶抗氧化活性虽有报道，但都是用80%乙醇[10]、70%丙酮[12]等提取，缺乏系统性的研究，因此本论文用不同极性溶剂提取蓝莓叶，对其提取物中的总酚和黄酮含量进行测定，并运用DPPH自由基、ABTS自由基、β-胡萝卜素-亚油酸体系等方法考察蓝莓叶不同极性溶剂提取物体外抗氧化能力，旨在为系统开发蓝莓植物资源在食品、医药和保健领域的应用提供实验支持。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

蓝莓叶样品 于2011年9月采自贵州省麻江县蓝莓种植基地，经重庆大学生物工程学院李正国教授鉴定为兔眼蓝莓（Vaccinium blueberry）叶；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、亚油酸、β-胡萝卜素、Folin-Ciocalteu 美国Sigma公司；没食子酸、芦丁、三氯化铝、2，6-二叔丁基对甲酚（BHT）、2，2-联氮基双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS）等 均为国产分析纯。

Lambda 900 型紫外分光光度计 美国Perlin Elmer公司；SPX-250B-D型振荡培养箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；BUCHI R205-V800型旋转蒸发仪 瑞士Buchi公司；冷冻干燥机 北京医博康实验仪器有限公司；干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司；FA2004型电子分析天平 上海恒平科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 蓝莓叶不同溶剂提取工艺 将新鲜蓝莓叶置于55℃干燥箱中干燥，粉碎过20目筛得蓝莓叶粉末，分别精密称取适量的蓝莓叶粉末6份，按1∶40（g/mL）比例加入不同提取溶剂（蒸馏水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、氯仿、石油醚），在水浴锅上回流提取3次，各2h（煮沸后）。抽滤后得不同溶剂提取液，在旋转蒸发仪上减压浓缩至近干时，用少量溶剂转移到蒸发皿中，经冷冻干燥得蓝莓叶不同溶剂提取物。精密称取各提取物，分别用50%甲醇溶解为质量浓度为2.0mg/mL的母液，置于-4℃冰箱中保存备用。

1.2.2 总酚含量测定[13]总酚含量用Folin-Ciocalteu试剂测定。

没食子酸标准曲线绘制：精密称取10.0mg没食子酸标准品，用50%甲醇溶解成浓度为2.5mg/mL的标准液。准确吸取标准品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL移入EP管中，加50%甲醇至1.0mL。取不同浓度标准品溶液各0.1mL，加入1.0mL 50% Folin-Ciocalteu试剂，混合1min后加入2.0mL 0.2g/L碳酸钠溶液，再用蒸馏水定容至5.0mL，充分振荡混匀后于25℃黑暗条件下温育2h，在760nm的波长处测定吸光值（A）。以没食子酸的质量浓度为纵坐标（Y），吸光值为横坐标（X），绘制标准曲线，得回归方程为Y=11.24X-1.013，R2=0.997，线性范围为2.0～10.0μg/mL。

总酚含量的测定：分别精密量取待测液0.1mL，按线性关系考察方法在760nm处测定吸光值，并根据没食子酸的标准曲线，计算各样品的总酚含量。

1.2.3 总黄酮含量测定[14]总黄酮含量用三氯化铝显色法测定。

芦丁标准曲线绘制：精密称取17.5mg芦丁标准品，用50%甲醇溶解成浓度为2.5mg/mL的标准液。准确吸取标准品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，移入EP管中，各加50%甲醇至1.0mL。取不同浓度的标准品溶液0.5mL，向其中加入0.1g/L AlCl3100μL，1mol/L醋酸酐100μL，加蒸馏水使其反应体系为3.0mL，充分振荡后于室温条件下放置30min，在415nm的波长处测定吸光值（A）。以芦丁的质量浓度为纵坐标（Y），吸光值为横坐标（X），绘制标准曲线，得回归方程为Y=31.32X+0.087，R2=0.999，线性范围为4.17～27.78μg/mL。

总黄酮含量测定：分别精密量取待测液0.5mL，按线性关系考察方法在415nm处测定吸光值，并根据芦丁的标准曲线，计算各样品的总黄酮含量。

1.2.4 抗氧化活性测定

1.2.4.1 清除DPPH自由基测定[15]0.1mL不同质量浓度的样品溶液和1.9mL 0.09mmol/L DPPH乙醇溶液混合，剧烈振荡后置黑暗条件下反应30min，在517nm波长处测定吸光度。以不加样品为空白对照，用2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）为阳性对照，对DPPH自由基的清除率按式（1）计算。

式中：Ao为空白样品吸光度；As为待测样品吸光度。

EC50值定义为清除50%自由基所需的样品质量浓度，其计算是通过获得的抑制DPPH自由基回归方程所得。以待测样品浓度为横坐标（X），抑制率为纵坐标（Y）得待测样品清除DPPH自由基的关系曲线。计算得到待测样品的半数抑制浓度（EC50）。

1.2.4.2 清除ABTS自由基测定[16]在浓度为7mmol/L ABTS溶液中加入过硫酸钾使其终浓度为2.45mmol/L，充分混合均匀，将混合反应液在室温避光的条件下放置12～16h（ABTS反应液须新鲜配制，保留的最长时间为3d）。在EP管中加入200μL样品溶液、300μL ABTS反应液，然后加入0.5mL 50%甲醇溶液，充分振荡均匀，反应2min后，在745nm处测定吸光度。以不加样品为空白对照，用BHT作为阳性对照，对ABTS自由基的清除率按式（1）计算。

以待测样品浓度为横坐标（X），抑制率为纵坐标（Y）得待测样品清除ABTS自由基的关系曲线。计算得到待测样品的半数抑制浓度（EC50）。

1.2.4.3 β-胡萝卜素/亚油酸体系中抗脂质过氧化作用的测定[17]在250mL旋转蒸发瓶中，加入1.0mL 0.2mg/mL的β-胡萝卜素氯仿溶液，再依次加入25μL亚油酸和200mg土温-40，混合均匀后，旋转蒸发氯仿，然后加入100mL氧饱和蒸馏水，剧烈振荡即得反应液。取上述反应液2400μL加入反应管中，加入不同浓度梯度的待测样品溶液100μL。在470nm处测定起始吸光度，50℃温育2h后再测定吸光度。以不加样品溶液的β-胡萝卜素/亚油酸体系作为空白对照。用BHT作为阳性对照，对脂质过氧化抑制率按式（2）计算。

式中：Aco、Act分别为空白样品起始和温育2h后的吸光度；Aso、Ast分别为待测样品起始和温育2h后的吸光度。

IC50值定义为反应被抑制一半时所需的样品浓度，其计算是通过获得的抗脂质过氧化能力的回归方程所得。以待测样品浓度为横坐标（X），脂质过氧化抑制率为纵坐标（Y）得待测样品抗脂质过氧化能力的关系曲线。计算得到待测样品的半数效应浓度（IC50）。

1.3 数据处理

所有实验数据均为3次重复实验结果的平均值。采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，方差分析运用Duncan极差法，数据以x±SD表示。

2 结果与分析

2.1 蓝莓叶提取物中有效成分含量

6种不同蓝莓叶提取物中总酚和黄酮含量测定结果见表1。结果表明，蓝莓叶提取物中总酚和黄酮含量随提取溶剂的不同而有所变化。水提取物的总酚含量最高，为（264.67±0.29）mg/g，随着提取溶剂极性的减小，含量逐渐减低，石油醚提取物的总酚含量最低，仅（10.12±0.20）mg/g；甲醇提取物中的黄酮含量最多，为（68.94±0.08）mg/g，然后依次是乙醇、水、乙酸乙酯提取物，分别是（59.99±0.05）mg/g、（53.34±0.02）mg/g、（37.02±0.06）mg/g，而氯仿、石油醚提取物中黄酮含量较少，仅3mg/g左右。

表1 不同溶剂的蓝莓叶提取物有效成分测定结果（n=3）Table 1 Total phenols and flavonoids contents of different extracts from Vaccinium blueberry leaves（n=3）

2.2 不同溶剂提取物清除DPPH自由基能力

DPPH自由基清除法已被广泛应用于从水果、蔬菜和天然中药材提取物等中，筛选抗氧化活性物质[18]。由图1可知，不同溶剂提取物对DPPH自由基表现出强弱不一的清除能力，且在一定浓度范围内（0.5～100.0μg/mL）呈明显的量效关系，其中水提取物对DPPH自由基的清除能力最强，其次是甲醇，均强于对照品2，6-二叔丁基对甲酚（BHT）；样品浓度在0.5～10.0μg/mL时，乙醇提取物的DPPH自由基清除能力比BHT强，随着浓度的增大，BHT的清除能力大于乙醇提取物；如表2和图1所示，相对于对照品BHT的EC50（23.96±0.03）μg/mL，水提物和甲醇提取物较小，分别为（12.78±0.10）、（18.74±0.02）μg/mL，各物质清除DPPH自由基能力为：水提取物＞甲醇提取物＞BHT＞乙醇提取物＞乙酸乙酯提取物＞氯仿提取物＞石油醚提取物，氯仿提取物和石油醚提取物差异不显著（p＞0.05），即氯仿提取物和石油醚提取物清除DPPH自由基能力相当，且活性很小。

2.3 不同溶剂提取物清除ABTS自由基能力

ABTS自由基清除法目前已被广泛应用于亲水性和亲脂性物质总抗氧化能力的测定[19]。由图2可知，不同极性溶剂提取物对ABTS自由基表现出强弱不一的清除能力，且在一定的浓度范围（0.4～12.9μg/mL）呈明显的量效关系。低浓度时，水提物对ABTS+·的清除率较阳性对照BHT强，但随着浓度的增大，BHT的清除活性增强。当样品浓度为12.9μg/mL时，各物质的ABTS自由基清除率分别为74.26%、63.88%、56.72%、16.96%、5.61%和4.66%。如图2各物质的半数清除浓度所示，物质清除ABTS自由基的能力为：水提取物＞BHT＞甲醇提取物＞乙醇提取物＞乙酸乙酯提取物＞氯仿提取物＞石油醚提取物，但BHT和甲醇、乙醇提取物，氯仿提取物和石油醚提取物差异不显著（p＞0.05），表示甲醇提取物与乙醇提取物清除ABTS自由基能力与BHT相当，氯仿提取物和石油醚提取物清除ABTS自由基能力相当。

图2 不同提取物清除ABTS自由基能力Fig.2 ABTS radical scavenging activity of different extracts from Vaccinium blueberry leave

表2 蓝莓叶不同极性溶剂提取物清除自由基EC50和抗脂质过氧化IC50Table 2 EC50 of scavenging capacities for free radicals and IC50 of anti-lipid peroxidation of different extracts from Vaccinium blueberry leaves

2.4 不同提取物的抗脂质过氧化能力

由图3可知，不同极性提取物表现出强弱不一的抗脂质过氧化能力，在一定的浓度范围（0.2～80.0μg/mL）呈现量效关系，但其抗脂质过氧化能力均小于阳性对照BHT，具有显著性差异（p＜0.05）；如表2所示，水提物、甲醇提取物对β-胡萝卜素淬灭的抑制能力的IC50分别为（25.33±0.02）μg/mL、（60.87±0.09）μg/mL，而乙醇、乙酸乙酯、石油醚提取物的IC50均大于80μg/mL，结合图3，各提取物的抗脂质过氧化能力为：水提取物＞甲醇提取物＞乙醇提取物＞乙酸乙酯提取物＞氯仿提取物＞石油醚提取物，氯仿提取物和石油醚提取物差异不显著（p＞0.05），表示氯仿提取物和石油醚提取物抗脂质过氧化能力相当，且能力均较弱。

图3 不同提取物抗脂质过氧化能力Fig.3 The activity of anti-lipid peroxidation of different extracts from Vaccinium blueberry leave

2.5 总酚和黄酮含量与抗氧化活性的相关性

如表3所示，浓度为20μg/mL的不同溶剂蓝莓叶提取物中总酚含量与抗氧化能力之间有较好的相关性，其中ABTS自由基清除能力、抗脂质过氧化能力与总酚的R2在0.97以上，对DPPH自由基的清除能力的相关系数也达到0.93，相关性极显著（p＜0.01），可以认为蓝莓叶提取物中总酚含量的多少直接反映提取物抗氧化能力的强弱。黄酮含量与DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力以及抗脂质过氧化能力的相关系数分别为0.840、0.823、0.638，有显著的相关性（p＜0.05），因此黄酮含量的多少与提取物抗氧化能力具有相关关系。

表3 蓝莓叶不同溶剂提取物总酚和黄酮与抗氧化活性的相关性（C=20μg/mL）Table 3 The correlation between content of the total phenols and flavonoids and the activity of different extracts from Vaccinium blueberry leaves（C=20μg/mL）

3 结果与讨论

为获得可信的结论，本研究采用DPPH自由基清除体系、ABTS自由基清除体系和β-胡萝卜-亚油酸体系对蓝莓叶不同极性溶剂提取物的抗氧化能力进行了综合评价。研究表明，蓝莓叶不同溶剂提取物的抗氧化活性存在较大差异，但三种评价体系所得出的其抗氧化能力的顺序一致，即水提取物＞甲醇提取物＞乙醇提取物＞乙酸乙酯提取物＞氯仿提取物＞石油醚提取物。水提物具有极强的清除自由基的活性，活性显著大于化学抗氧化剂BHT，差异显著（p＜0.01）；具有中等强度的抗脂质过氧化的能力，半数抑制浓度为（25.33±0.02）μg/mL。很多研究均表明天然提取物的抗氧化的能力强于化学合成的抗氧化剂，如Mehmet[20]发现薄荷提取物的清除DPPH自由基的活性优于阳性对照BHT，Masoumeh等[21]在研究艾菊提取物的抗氧化活性时发现其DPPH自由基清除活性比阳性对照BHT好。在已报道的对蓝莓叶抗氧化的研究中，主要使用的提取溶剂为有机类溶剂，如Marian[12]等用70%丙酮、Zhao等[22]用60%乙醇提取蓝莓叶测定提取物的抗氧化活性，但本研究证明以水作为提取溶剂能够获得抗氧化活性最好的提取物。

已有大量的研究表明，酚类化合物是天然植物提取物中具有抗氧化活性的主要物质基础，而黄酮类化合物是植物为抵抗外部环境，如紫外线等产生的一类含量最为丰富酚类化合物。因此本实验测定了各提取物的总酚和总黄酮的含量，并应用SPSS 17.0对总酚和总黄酮的含量与抗氧化活性的相关性进行了统计分析。结果表明，总酚含量与提取物抗氧化活性具有极显著相关性（p＜0.01），与总黄酮含量具有显著相关性（p＜0.05），这提示蓝莓叶中除黄酮类化合物外，还存在其他具有抗氧化活性的酚类化合物，另外结合水提物的总酚含量最高、活性最强可以推断蓝莓叶中存在的其他抗氧化成分的极性相对比较大。因此可以选择总酚含量作为蓝莓叶抗氧化提取物质量评价的指标。

如今人们越来越重视自身的健康和食品的营养要求，从植物中提取天然抗氧化剂是食品和医疗保健行业发展的一种趋势。本研究表明相对于有机溶剂，水提物的抗氧化活性好、活性成分含量高，避免了有机溶剂残留问题，为蓝莓叶保健品的研究与开发进行了有益的探索，促进蓝莓资源的综合开发和利用。

[1] Cadenas E，Davies K. Mitochondrial free radical generation，oxidative stress，and aging[J].Free Radical Biology and Medicine，2000，29：222-230.

[2] Slater T F. Free-radical mechanism in tissue injury[J].Biochemical Journal，1984，222：1-15.

[3] Drige W. Free radical in the physiological control of cell function[J]. Physical Review，2001，82：47-95.

[4] 杨锦华，李博，籍保平. 我国常见食用和药用植物的抗氧化性研究[J]. 食品科学，2006，27（6）：87-91.

[5] Cai Y Z，Luo Q，Sun M，et al. Antioxidant activity and phenolic compounds of 112 traditional Chinese medicinal plants associated with anticancer[J]. Life Science，2004，74：2157-2184.

[6] Lee S E，Hwang H J，Ha J S，et al. Screening of medicinal plant extracts for antioxidant activity[J]. Life Science，2003，73：167-179.

[7] Huang W Y，Zhang H C，Liu C Y，et al. Survey of antioxidant capacity and phenolic composition of blueberry，blackberry，and strawberry in Nanjing[J]. Journal of Zhejiang University-SCIENCE B（Biomedicine and Biotechnology），2012，13（2）：94-102.

[8] Ehlenfeldt M K，Prior R L. Oxygen Radical Absorbance Capacity（ORAC）and phenolic and anthocyanin concentrations in fruit and leaf tissues of highbush blueberry[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2001，49：2222-2227.

[9] Watson E M. Some observations on the effect of blueberry leaf extract in diabetes mellitus[J]. The Canadian Medical Association Journal，1928：166-171.

[10] Li Y C，Li B X，Geng L J. Hypolipidemic and antioxidant effects of total flavonoids from blueberry leaves[J]. European Food Research and Technology，2011，233：897-903.

[11] Mechikova G Y，Kuzmich A S. Cancer-preventive activities of secondary metabolites from leaves of the bilberry Vaccinium smallii A. gray[J]. Phytotherapy Research，2010，24：1730-1732.

[12] Marian N，Ryszard A，Ryszard Z D，et al. Antioxidant activity of crude phenolic extracts from wild blueberry leaves[J].Polish Journal of Food and Nutrition Science，2003，53（12）：166-169.

[13] Singleton V L，Orthofer R，Lamuela -Raventòs R M.Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu reagent[J]. Methods in Enzymol，1999，299：152-178.

[14] Awah F M. Uzoegwu P N，Ifeonu P，et al. Free radical scavenging activity，phenolic contents and cytotoxicity of selected Nigerian medicinal plants[J]. Food Chemistry，2012，131：1279-1286.

[15] Duan X W，Jiang Y M，Su X G，et al. Antioxidant properties of anthocyanins extracted from litchi（Litchi chinenesis Sonn.）fruit pericarp tissues in relation to their role in the pericarp browning[J]. Food Chemistry，2007，101：1365-1371.

[16] Garzon G A，Wrolstad R E. Major anthocyanins and antioxidant activity of Nasturium flowers（Tropaeolum majus）[J].Food Chemistry，2009，114：44-49.

[17] Yesilyurt V，Halfon B，Ozturk M，et al. Antioxidant potential and phenolic constituents of Salvia cedronella[J].Food Chemistry，2008，108：31-39.

[18] Sanchez M C. Review：methods used to evaluate the free radical scavenging activity infoods and biological systems[J].Food Science and Technology International，2002（8）：121-137.

[19] Re R，Pellegrini N，Proteggente A，et al. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay[J]. Free Radical Biology and Medicine，1999，26：1231 -1237.

[20] Mehmet O. Anticholinesterase and antioxidant activities of Savoury（Satureja thymbra L.）with identified major terpenes of the essential oil[J]. Food Chemistry，2012，134：48-54.

[21] Masoumeh F，Zahra T，Ali S. Essential oil composition and antioxidant of the various extracts of Tanacetum sonbolii Mozaff.（Asteraceae）from Tran[J]. Nature Product Research，2012，26（23）：2204-2207.

[22] Zhao H T，Wang Z Y，Cheng C L，et al. In-vitro free radical scavenging activities of anthocyanins from three berries [J].Journal of Medicinal Plants Research，2012，6（1）：101-107.