刘小燕，李时悦，陈小波

(1广州番禺区中心医院呼吸内科，广东广州511400；2.广州医学院第一附属医院广州呼吸疾病研究所，广东广州510120)

·论著·

全身热疗联合地塞米松对大鼠肺纤维化治疗作用

刘小燕1，李时悦2，陈小波2

(1广州番禺区中心医院呼吸内科，广东广州511400；2.广州医学院第一附属医院广州呼吸疾病研究所，广东广州510120)

目的探讨全身热疗联合地塞米松对大鼠肺纤维化的治疗作用。方法48只雄性SD(Sprague Dawley)大鼠随机分为四组，即正常对照组(N组)、模型组(M组)、地塞米松治疗组(D组)和全身热疗联合地塞米松治疗组(DW组)，N组气管内注入生理盐水，其他三组气管内注入博莱霉素造模成功后分别给予相应的治疗，各组动物在第28天处死，对苏木精伊红染色(HE)肺组织病理结果进行半定量评分，用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测肺泡灌洗液(BALF)中IFN-γ的含量。结果DW组与D组比较，前者的纤维化程度减轻(1.250分vs 2.000分，P＜0.05)，BALF中IFN-γ的含量增高[(30.397±5.015)pg/ml vs(23.801±3.256)pg/ml，P＜0.05]。结论全身热疗可以增强地塞米松对大鼠肺纤维化的治疗作用。

全身热疗；地塞米松；肺纤维化

特发性肺纤维化(Idiopathic Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一种原因不明的慢性炎症性间质性肺疾病，目前尚无有效的治疗药物可以延长患者的生存期。全身热疗作为一种绿色疗法已广泛应用于肿瘤和一些良性疾病的治疗上，尤其是其对化疗和放疗的增敏作用[1]受到大多数学者的关注，我们从这些研究中发现全身热疗从作用机制、细胞水平以及细胞因子水平等方面可能对治疗肺纤维化有利。本试验通过对大鼠肺组织纤维化的半定量评分和支气管肺泡灌洗液(BALF)中IFN-γ含量测定，观察全身热疗联合地塞米松对大鼠肺纤维化的治疗作用。

1 资料与方法

1.1 试剂博莱霉素针剂(日本化药株式会社，Z50370)；地塞米松磷酸钠注射液(山东华信制药有限公司，H37021467)；大鼠IFN-γ酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(上海森雄科技实业有限公司产品)。

1.2 仪器DK8A恒温水浴锅(温度波动：±0.1，上海精宏试验仪器有限公司)；6801A热电偶测温仪(深圳市胜利高电子科技有限公司)。

1.3 实验分组、纤维化模型的建立和标本处理

1.3.1 实验分组和模型建立48只SD雄性大鼠，体重180～220 g，随机分为四组，即正常对照组(N组)、模型组(M组)、地塞米松治疗组(D组)和全身热疗联合地塞米松治疗组(DW组)，用1.5%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后切开大鼠颈部皮肤，肉眼下用注射器将博来霉素按5 mg/kg剂量注入气管[2]，N组则注入生理盐水0.25～0.3 ml。N组和M组：造模后每日腹腔注射5%葡萄糖1 ml；D组：造模后每日按3 mg/kg剂量腹腔注射地塞米松注射液；DW组：在D组治疗的基础上，用水浴法给予每次1 h 40℃全身热疗(2次/周)，疗程为4周。

1.3.2 标本的获取和处理各组大鼠于造模后第28天处死，分离出气管和双肺，结扎右侧肺门，将气管插管缓缓插入左主支气管，用注射器将2.5 ml生理盐水通过导管注人肺内，然后回抽灌洗液，反复10次，最后1次回抽的灌洗液盛入15 ml的离心管，离心管置于冰浴中，重复4次上述操作。对所得标本进行计量，并离心10 min，上清液放入-70℃冰箱中，用于测定IFN-γ含量，取右下肺叶进行病理组织学检查。

1.4 大鼠肺组织纤维化半定量评分光镜下(4×10)评估每张切片上肺纤维化的面积，使用AxioVision LE图像信息采集系统进行图像采集和评分(蔡司远东有限公司)。评分标准如表1。

表1 大鼠肺纤维化组织的病理半定量评分标准

1.5 IFN-γ含量测定采用ELISA法检测支气管肺泡灌洗液中IFN-γ的含量。

1.6 统计学方法采用SPSS12.0软件包进行统计学分析。所有计量资料以均数±标准差表示，病理半定量资料采用秩和检验，多组间比较采用方差分析，两两比较用LSD-t检验，P＜0.05即认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病理半定量评分分析与M组比较，D组和DW组肺纤维化范围和程度均减轻，差异有统计学意义(P＜0.05)；与D组比较，DW组肺纤维化范围和程度进一步减轻，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

2.2 BALF中IFN-γ含量比较支气管肺泡灌洗液中IFN-γ含量(pg/ml)与N组比较，M组BALF中IFN-γ含量下降，差异有统计学意义(P＜0.05)；与M组比较，D组和DW组BALF中IFN-γ含量均增高，差异有统计学意义(P＜0.05)；与D组比较，DW组BALF中IFN-γ含量升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表3。

表3 不同组别大鼠BALF中IFN-γ含量检测比较

表3 不同组别大鼠BALF中IFN-γ含量检测比较

注：aM组与N组比较，P=0.027＜0.05，DW组与N组比较，P=0.038＜0.05；bD组与M组比较，P=0.044＜0.05，DW组与M组比较，P=0.003＜0.05；cDW组与D组比较，P=0.006＜0.05。

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3 讨论

全身热疗在治疗肿瘤和一些良性疾病(慢性盆腔炎、前列腺肥大、痛经等)方面的疗效已经被大多数学者认可，但尚未有治疗肺纤维化的相关报道。中国热疗治疗专家李鼎九在对放疗引起的放射性肺炎、肺纤维化患者的药物治疗观察中发现，同时进行全身热疗患者的肺纤维化程度有所减轻；张杰等[3]对33例放疗引起皮下组织纤维化的患者采用微波热疗的总有效率达到87.9%。在预试验中，我们观察了单纯热疗对大鼠肺纤维化的治疗作用，发现肺纤维改善并不明显，因此我们推测单独热疗还不足以代替常规药物达到满意治疗肺纤维化的作用，类似于热疗对肿瘤化疗和放疗的增敏[4]作用，若其与治疗肺纤维化的药物联用则可能通过增强机体对药物的敏感性，增加机体免疫细胞的活性，调节细胞因子的表达等对肺纤维化具有一定的辅助治疗作用。本试验结果表明，热疗联合激素与单纯激素治疗相比，试验大鼠的肺组织病理变化有所减轻，提示热疗对激素治疗肺纤维化有一定的增强作用。

作用机制方面，IFN-γ主要由CD8+T细胞和某些CD4+T细胞产生，具有一定的抗纤维化作用，有研究也表明IFN-γ受体缺失可诱发大鼠纤维化[5]，而且目前IFN-γ已用于肺纤维化治疗的2期、3期临床试验[6]，本实验结果提示全身热疗可能通过增加IFN-γ的含量从而增强地塞米松对肺纤维化的治疗作用。结合既往的一些研究，热疗还可能通过以下四个环节发挥作用：①全身热疗时体温升高，组织血管扩张，加温破坏了细胞膜的稳定性，使膜的通透性增加，有利于化疗药物的渗透和吸收[1]；具有一定的热增强效应。②改善血液微循环，明显改善肺内的通气/血流比例而发挥治疗作用；同时血循环的改善加速了局部代谢产物的移除，使渗出减少[7]，有利于炎症消退以及有害细胞因子的清除。③肺纤维化的发病机制认为Th1/Th2细胞因子比例失衡在纤维化的过程中发挥重要的作用[8]，洪晓军等[9]通过研究观察到热疗可以提高荷瘤鼠IL-2水平，热疗可刺激B淋巴细胞活化，其释放的IFN-γ、IL-2等辅助性细胞因子(Th1类)，可纠正Th1/Th2细胞因子失衡达到治疗作用。④细胞凋亡方面，IPF患者的凋亡相关基因bcl-2表达下调而Bax明显上调[10]，在对肿瘤进行热疗的研究中则表现为bcl-2表达上调而Bax成下调趋势[4,11]。

综上所述，我们仅从本试验和理论推测热疗可以增强地塞米松对大鼠肺纤维化的治疗作用，其应用到临床是否能发挥作用、如何应用才能发挥最佳的疗效以及其作用机制如何还有待进一步研究和明确。

(志谢：本试验得到中国肿瘤治疗专家李鼎九教授和广州祈福医院孔寒梦主任的大力帮助和支持，特此感谢！)

[1]Mohamed F,Marchettini P,Stuart OA,et al.Thermal enhancement of new chemotherapeutic agents at moderate hyperthermia[J].Ann Surg Oncol,2003,10(4):463-468.

[2]高春苏,陆伦根.纤维化疾病的基础和临床[M].上海:上海科学技术出版社,2004:468.

[3]张杰,郭毅,王克兰,等.微波热疗对组织纤维化近期疗效的观察与分析[J].滨州医学院学报,2002,25(5):391.

[4]李鼎九,胡自省,钟毓斌.肿瘤热疗学[M].郑州:郑州大学出版社, 2002:93-96,144.

[5]Mora AL,Torres-Gonzalez E,Roias M,et al.Control of virus reactivation arrests pulmonary herpesvirus-induced fibrosis in IFN-γreceptor-deficient mice[J].Am J Respir Crit Care Med,2007,175 (11):1139-1150.

[6]班健.特发性肺纤维化的治疗进展[J].临床肺科杂志,2011,16 (9):1432-1434.

[7]刘宏亮.毫米波疗法的研究应用及有关问题[J].国外医学:物理医学与康复学分册,1998,18:154-156.

[8]Kikuchi N,Ishii Y,Morishima Y,et al.Nrf2 protects against pulmonary fibrosis by regulating the lung oxidant level and Th1/Th2 balance[J].Respir Res,2010,11:31.

[9]洪晓军,毛祖彝,王升志,等.热化疗对荷瘤鼠IL-2、TNF水平影响的研究[J].四川肿瘤防治,2002,15:65-67.

[10]Kang HR,Cho SJ,Lee CG,et al.Transforming growth factor (TGF)-beta1 stimulates pulmonary fibrosis and inflammation via a Bax-dependent,bid-activated pathway that involves matrix metalloproteinase-12[J].J Biol Chem,2007,282:7723-7732.

[11]Zhang TJ,Hang J,Wen DX,et al.Hippocampus bcl-2 and bax expression and neuronal apoptosis after moderate hypothermic cardiopulmonary bypass in rats[J].Anesth Analg,2006,102:1018-1025.

Therapeutic effect of whole body hyperthermia combined with dexamethasone on pulmonary fibrosis in rats.

LIU Xiao-yan1,LI Shi-yue2,CHEN Xiao-bo2.1.Department of Respiratory Medicine,Guangzhou Panyu People's Hospital,Guangzhou 511400,Guangdong,CHINA;2.Guangzhou Institute of Respiratory Disease,the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College,Guangzhou 510120,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the therapeutic effect of whole body hyperthermia combined with dexamethasone in the treatment of pulmonary fibrosis in rats.MethodsForty-eight SD rats were randomly divided into four groups:normal group(group N),model group(group M),dexamethasone group(group D)and whole body hyperthermia combined with dexamethasone group(group DW).Fibrosis was induced in rats by intratracheal instillation of saline(group N)or bleomycin(the other groups),then each group received corresponding treatment and was put into death after 28 days.Semi-quantitative analysis of the histopathologic changes stained with hemotoxylin and eosin (HE),the concentration of IFN-γ in BALF were measured with ELISA.ResultsThe degree of fibrosis decreased (1.250 vs 2.000,P＜0.05)and the content of IFN-γ in BALF increased[(30.397±5.015)pg/ml vs(23.801±3.256)pg/ml,P＜0.05]significantly in group DW as compared with group D.ConclusionWhole body hyperthermia could enhance the treatment function of dexamethasone for pulmonary fibrosis in rats.

Whole body hyperthermia;Dexamethasone;Pulmonary fibrosis

R-332

A

1003—6350（2013）03—0316—02

10.3969/j.issn.1003-6350.2013.03.0141

2012-07-20)

刘小燕。E-mail：liuxiaoyan1892@163.com