瞿 亮，任路静，黄 和

（南京工业大学生物与制药工程学院材料化学工程国家重点实验室，南京210009）

裂殖壶菌发酵产DHA过程呼吸参数的在线检测分析

瞿 亮，任路静，黄 和

（南京工业大学生物与制药工程学院材料化学工程国家重点实验室，南京210009）

利用尾气分析仪对发酵过程的尾气中的O2、CO2含量进行实时检测，建立了裂殖弧菌发酵生产DHA过程中的呼吸参数在线检测方法，实现了裂殖壶菌补料分批发酵过程及双阶段供氧控制发酵过程中的呼吸参数在线检测分析。通过呼吸参数在线检测分析，从氧消耗机制方面解释了双阶段氧传递控制工艺能获得较高生物量、油脂和DHA含量的原因，从而为该工艺过程提供了理论指导。根据发酵过程中菌体生长不同时期的呼吸参数的变化情况，建立了基于呼吸商变化的在线补料控制方法，设计了一种基于RQ⁃Stat的补料工艺。RQ⁃Stat补料方式最终获得的油脂含量、DHA产量和产率比间歇式补料工艺分别提高了11.58%、12.19%和11.40%。

DHA；裂殖壶菌；补料工艺；呼吸参数

二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA），是一种重要的长链多不饱和脂肪酸，由于其对婴幼儿和成人健康方面的益处而受到广泛的关注［1］。裂殖壶菌，作为一种海洋真菌，具有合成大量富含DHA的微生物油脂的能力，是生产DHA的理想菌种［2］。一些研究表明O2供应条件对裂殖壶菌发酵生产DHA过程中的细胞生长和DHA合成有显著的影响［3-6］。

呼吸商（respiratory quotient，RQ），是指生物体在同一时间内呼吸作用所释放的CO2和吸收的O2的分子比，是反映微生物菌体细胞活力和生理特性的一个重要参数，一般可以通过尾气分析计算得到。微生物发酵过程中呼吸商的在线监测可以反映菌体对有关基质代谢情况的信息及发酵过程供氧及O2消耗情况，目前已成功运用在好氧微生物发酵过程的变量补料控制和测量方面［7］。

笔者所在课题组前期对裂殖壶菌发酵生产DHA过程的供氧调控方面做了一些研究工作［5-6］。本文中从裂殖壶菌发酵产DHA过程的呼吸参数角度进行研究，利用尾气分析仪对发酵过程的尾气中的O2、CO2含量进行实时检测，以期实现对补料分批发酵过程及双阶段补料分批发酵过程的各个时期的呼吸参数的在线监测分析，并且在此基础上开发一种基于呼吸商在线检测的RQ⁃Stat补料工艺。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

裂殖壶菌（Schizochytrium sp.）CCTCCM209059，从海水中分离筛选获得，保藏在中国典型微生物培养中心（CCTCC）。

1.1.2 培养基及培养条件

种子培养基组成和种子培养条件参照文献［8］。补料分批发酵在装有7 L发酵培养基的10 L发酵罐中进行，25℃恒温培养，其他发酵条件参照文献［6］。

1.2 分析检测方法

葡萄糖、谷氨酸、细胞干质量、脂质提取和脂肪酸甲酯化方法参照文献［8］。气相色谱（GC）分析脂肪酸组成并且用十九烷酸甲酯（C19∶0甲酯）作为内标定量测定DHA的含量［9］。发酵罐尾气中的O2和CO2含量采用尾气分析仪（Megellan Instruments公司，Tandem Multiplex）检测。

1.3 呼吸参数在线检测方法

利用尾气分析仪，实时检测发酵过程中尾气的O2含量，并根据进入发酵液的空气体积流量，发酵液体积等参数，利用式（1）即可计算出氧利用速率（vO）。

式中：Fɑ，i为进入发酵液的空气在标准状态下的体积流量（m3／h）；V为发酵液体积，m3；φ（CO2）i为进入发酵液的空气中O2的体积分数；φ（CO2）o为排出发酵液的空气中的O2体积分数。

同O2消耗速率一样，利用尾气分析仪，实时检测发酵过程中尾气的CO2含量，并根据进入发酵液的空气体积流量，发酵液体积等参数，利用式（2）即可计算出CO2释放速率（vC）。

式中：Fɑ，i为进入发酵液的空气在标准状态下的体积流量（m3／h）；V为发酵液体积，m3；φ（CO2）i为进入发酵液的空气中CO2的体积分数；φ（CO2）o为排出发酵液的空气中CO2的体积分数。

呼吸商（RQ）由CO2释放速率除以O2消耗速率求得。

2 结果与讨论

2.1 裂殖壶菌发酵过程呼吸参数在线检测分析

2.1.1 裂殖壶菌补料分批发酵过程的呼吸参数在线检测分析

在10 L发酵罐中，进行裂殖壶菌的补料分批发酵，利用尾气分析仪对发酵过程的尾气中的O2和CO2含量进行实时检测，实现对发酵过程的各个时期的呼吸参数的在线监测。发酵结果及发酵过程的呼吸商变化情况如图1、图2所示。

由图1和图2可知：发酵初始阶段，RQ不断增加，直至大于1；在补加葡萄糖前后，呼吸商有个明显变化的过程，46和70 h这2个时间点，是葡萄糖耗到0后再补加葡萄糖的时间，补加前后RQ有明显的变化，补加前呼吸商在1.0以下，补加后RQ在1.0以上。

这是由于在葡萄糖供应充足的条件下，菌体如果在供氧充分时利用葡萄糖，RQ为1；葡萄糖的供给大于供氧条件，则会利用葡萄糖产生其他代谢产物，RQ大于1；而葡萄糖不足的时候，菌体会利用油脂或其他成分，则RQ就会小于1。因此，在发酵过程中，如果通过调节呼吸商保持在1左右，会使得葡萄糖浓度保持在一个较低的水平，从而减少其他代谢产物的生成。

图1 裂殖壶菌补料分批发酵过程曲线Fig.1 Time courses of DHA production in fed⁃batch fermentation process by Schizochytrium sp.

图2 裂殖壶菌补料分批发酵过程RQ的变化Fig.2 Changes of RQ in fed⁃batch fermentation process by Schizochytrium sp.

2.1.2 裂殖壶菌双阶段氧传递控制补料分批发酵过程的呼吸参数在线检测分析

裂殖壶菌的分批补料发酵过程中存在着生物量增长和油脂积累两个阶段，这两个阶段细胞对溶解氧的需求不同，在笔者之前的研究工作中，曾经设计了一种在生物量增长阶段采用较高的供氧条件，油脂积累阶段将供氧水平降低的双阶段氧传递控制的发酵工艺［6］，本研究将采用前面建立的呼吸参数在线检测的方法，对双阶段氧传递控制的发酵过程的呼吸参数进行在线检测分析，从而为该工艺方法提供一定的理论支持。

采用10 L发酵罐进行裂殖壶菌的分批补料发酵，通过改变不同的搅拌速率，实现双阶段的氧传递控制，通过尾气分析仪检测发酵过程尾气中的O2和CO2含量，实现对双阶段O2传递控制的发酵过程的呼吸参数在线检测分析。发酵结果与发酵过程的呼吸参数情况见图3和图4。

图3 裂殖壶菌双阶段氧传递控制补料分批发酵过程曲线Fig.3 Time courses of DHA production in two⁃stage oxygen supp ly control fed⁃batch fermentation p rocess by Schizochytrium sp.

图4 裂殖壶菌双阶段氧传递控制补料分批发酵过程呼吸参数的变化Fig.4 Changes of vc，vo，and RQ in two⁃stage oxygen supply control fed⁃batch fermentation process by Schizochytrium sp.

从图3中可以看出，采用双阶段氧传递工艺的补料分批发酵过程，最终获得的生物量、油脂含量及DHA含量比补料分批发酵过程均有一定的提高，分别提高了3.06%、14.61%和11.45%。图4中显示的该过程的呼吸参数变化情况，说明在发酵前期，采用较高供氧条件时，发酵体系的O2消耗速率和CO2释放速率均较高，表明在高供氧条件下，菌体的呼吸作用更加旺盛，这就有利于菌体生长阶段的生物量的增加，而在发酵中后期，降低了供氧条件，使得菌体的呼吸作用也降低，从而有利于油脂的积累，也有利于DHA的合成，这是由于在油脂积累阶段，较高的O2供应会导致更多的C源用作细胞呼吸和能量代谢，而不是用作油脂合成。因此，在油脂积累阶段减少O2的供应可以提高C源利用效率从而增加油脂积累。此外，对裂殖壶菌而言，长链多不饱和脂肪酸如DHA的合成是通过一种多不饱和脂肪酸合成酶途径实现的，而该过程不需要分子氧的参与［10］。

2.2 基于RQ控制的裂殖壶菌分批发酵的补料工艺研究

根据图2中裂殖壶菌发酵过程的RQ变化情况分析，如果在发酵过程中将RQ保持在1左右，会使得葡萄糖浓度保持在一个较低的水平，从而减少其他代谢产物的生成，有利于C源在裂殖壶菌体内流向油脂和DHA合成途径，从而有利于油脂和DHA的积累。并且2.2.2中双阶段氧传递控制补料分批发酵过程的呼吸参数分析也表明，在发酵中后期降低供氧条件也有利于油脂的积累以及DHA通过不需要O2的途径积累，因此通过将RQ保持在1左右，可以将发酵过程氧供应保持在较低水平，从而有利于DHA的积累。根据对裂殖壶菌发酵过程的油脂和DHA积累和合成途径的分析以及发酵过程呼吸参数情况的分析，笔者设计了一种基于RQ在线监测的RQ⁃Stat的补料工艺，该工艺是在发酵中期开始，当监测到的RQ低于1的时候，开始启动补料，以一定的速度向发酵罐内流加一定浓度的葡萄糖溶液，直到RQ大于1的时候，停止流加，如此反复进行，直到发酵结束。

采用RQ⁃Stat的补料工艺，在10 L发酵罐上进行了裂殖壶菌的分批补料发酵，发酵结果以及发酵过程的RQ变化情况如图5和图6所示。

图5 裂殖壶菌RQ⁃Stat补料工艺的分批发酵过程曲线Fig.5 Time courses of DHA production in RQ⁃Stat fed⁃batch fermentation process by Schizochytrium sp.

从图5和图6可以看出，通过基于发酵过程的呼吸商控制的补料方式，使得发酵过程中的葡萄糖浓度维持在了一个较低的水平。RQ⁃Stat的补料工艺的发酵结果与间歇式的补料工艺的发酵结果的比较，结果如表1所示。

图6 裂殖壶菌RQ⁃Stat补料工艺的分批发酵过程RQ的变化Fig.6 Changes of RQ in RQ⁃Stat fed⁃batch fermentation process by Schizochytrium sp.

表1 裂殖壶菌产DHA的不同补料工艺的发酵结果Table 1 Fermentation results of different feeding processes for DHA production by Schizochytrium sp.

由表1中可知：采用RQ⁃Stat的补料工艺，由于发酵过程中的葡萄糖浓度维持在较低水平，最终得到的生物量较低，但是由于其他代谢产物的减少，以及发酵过程中O2供应维持在较低水平，使得最终获得的油脂含量、DHA产量和产率比间歇式补料工艺分别提高了11.58%、12.19%和11.40%。此外，由于该工艺是基于RQ在线检测控制的补料工艺，可以实现发酵过程补料的自动化控制。

3 结 论

通过对裂殖壶菌产DHA的发酵过程尾气中的O2和CO2含量进行实时检测，对裂殖壶菌发酵产DHA过程的呼吸参数在线检测分析方法，实现了对补料分批发酵过程及双阶段补料分批发酵过程的各个时期的呼吸参数的在线检测分析，从而获得了裂殖壶菌补料分批发酵过程的相关基质代谢情况及氧消耗情况的信息。此外，在对补料分批发酵过程的RQ变化情况的在线检测分析基础上，开发出一种基于RQ在线检测的RQ⁃Stat补料工艺，最终获得的油脂含量、DHA产量和产率比间歇式补料工艺分别提高了11.58%、12.19%和11.40%，并且该补料工艺可以实现发酵过程补料的自动化控制。

参考文献：

［1］ Sijtsma L，de Swaaf M E.Biotechnological production and applications of theω⁃3 polyunsaturated fatty acid docosahexaenoic acid［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2004，64（2）：146⁃153.

［2］ 冯云，任路静，魏萍，等.微生物发酵产二十二碳六烯酸代谢机理的研究进展［J］.生物工程学报，2010，26（9）：1225⁃1231.

［3］ Jakobsen A N，Aasen IM，Josefsen K D，et al.Accumulation of docosahexaenoic acid⁃rich lipid in thraustochytrid Aurantiochytrium sp.strain T66：effects of N and P starvation and O2limitation［J］. Appl Microbiol Biotechnol，2008，80：297⁃306.

［4］ Chi Z Y，Liu Y，Frear C，et al.Study of a two⁃stage growth of DHA⁃producing marine algae Aurantiochytrium limacinum SR21 with shifting dissolved oxygen level［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2009，81：1141⁃1148.

［5］ Ren L J，Ji X J，Huang H，et al.Development of a stepwise aeration control strategy for efficient docosahexaenoic acid production by Schizochytrium sp［J］.Appl Microbiol Biotechnol， 2010，87：1649⁃1656.

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［8］ Ren L J，Huang H，Xiao A H，et al.Enhanced docosahexaenoic acid production by reinforcing acetyl⁃CoA and NADPH supply in Schizochytrium sp.HX⁃308［J］.Bioprocess Biosyst Eng，2009，32：837⁃843.

［9］ 金立晶，纪晓俊，任路静，等.海洋真菌产油脂中DHA含量的准确快速测定［J］.生物加工过程，2010，8（4）：67⁃71.

［10］ Metz J G，Roessler P，Facciotti D，et al.Production of polyunsaturated fatty acids by polyketide synthases in both prokaryotes and eukaryotes［J］.Science，2001，293：290⁃293.

Online analysis of respiratory parameters in fed⁃batch fermentation process for DHA production by Schizochytrium sp.

QU Liang，REN Lujing，HUANG He

（College of Life Science and Pharmaceutical Engineering，State Key Laboratory of Materials⁃Oriented Chemical Engineering，Nanjing University of Technology，Nanjing 210009，China）

A method for online analysis of respiratory parameters in fermentation process for DHA production by Schizochytrium sp.was developed by detecting the concentration of oxygen and carbon dioxide in the exhaust gas online using exhaust gas analyzer.Online analysis of the respiratory parameters in fed⁃batch fermentation process and two⁃stage oxygen supply fed⁃batch process was accomplished.The theoretical explanation for the improvement of biomass，lipids and DHA content was made by using respiratory parameter online analysis，providing theoretical guidance for the two⁃stage oxygen supply process.In addition，according to the change of respiratory parameters in different growth periods of fermentation process，the online automatic feeding controlmethod based on changes in respiratory quotient was built and a RQ⁃Stat feeding processwas designed.The fermentation results of lipids and DHA content and DHA productivity were increased by 11.58%，12.19%，and 11.40%，higher than that of the pulse feeding process.

DHA；Schizochytrium；feeding strategy；respiratory parameter

R282.71

A

1672-3678（2013）06-0058-05

10.3969／j.issn.1672-3678.2013.06.012

2012-12-31

国家高技术研究发展计划（863计划）（2012AA021704）；国家科技支撑计划（2011BAD23B03）；江苏省自然科学基金（BK2012424）；江苏省普通高校研究生科研创新计划（CXLX11＿0366）

瞿 亮（1986—），男，江苏镇江人，博士研究生，研究方向：生物化工；任路静（联系人）：讲师，E⁃mail：renlujing＠njut.edu.cn