吕汕群 姚婷婷* 黄诺洁 庄 敏

（1 汕头市中心医院妇产科，广东 汕头 515031；2 中山大学孙逸仙纪念医院妇产科，广东 广州 510120）

mTOR和PTEN在宫颈鳞癌中的表达及意义

吕汕群1姚婷婷2* 黄诺洁1庄 敏1

（1 汕头市中心医院妇产科，广东 汕头 515031；2 中山大学孙逸仙纪念医院妇产科，广东 广州 510120）

目的 PI3 K/PTEN/AKT/mTOR信号传导通路具有重要的细胞调节功能，对肿瘤的发生发展也发挥着重要的作用。但目前宫颈鳞癌中该通路的研究尚不充分。本研究拟检测不同宫颈病变组织中mTOR和PTEN 蛋白的表达,探讨该信号转导途径与宫颈鳞癌生物学行为的关系。方法采用免疫组化SP法检测宫颈鳞癌70例、正常宫颈组织20例中mTOR和PTEN的表达情况，并分析与宫颈癌临床病理因素的关系。结果mTOR蛋白在正常宫颈组织中阳性表达率为5%,显著低于宫颈鳞癌组织85.7%（P＜0.01）。PTEN蛋白在正常宫颈组织阳性表达率为100.0%，显著高于宫颈鳞癌组织70.0%（P＜0.01）。mTOR蛋白的表达与宫颈鳞癌患者临床分期有关（P＜0.05），与病理分级、淋巴转移无关（P＞0.05）。PTEN蛋白的表达与宫颈鳞癌患者临床分期、病理分级、淋巴转移无关。宫颈鳞癌组织中随着mTOR表达的增强，PTEN表达的阳性率降低。二者呈负相关（P＜0.01）。结论mTOR蛋白的高表达和PTEN蛋白的低表达对宫颈鳞癌细胞的增殖、浸润和转移有一定的生物学意义。

宫颈鳞癌；雷帕霉素靶蛋白；第10染色体同源丢失磷酸酶-张力蛋白基因；免疫组织化学

宫颈癌是全球妇女第二高发恶性肿瘤，仅次于乳腺癌，在发展中国家其发病率居第一位。近年来，宫颈癌的发病率有明显上升趋势，尤其是年轻宫颈癌病人。宫颈癌中80%是鳞癌。其病因及发病机制至今不明。在恶性肿瘤细胞的增殖、分化过程中，PI3 K/AKT/PTEN/ mTOR信号转导通路起着重要的作用。而在这条信号转导通路中，PTEN作为一种具有磷酸酶活性的肿瘤抑制基因，在人类许多肿瘤和遗传性肿瘤易感综合征中均存在突变或缺失。mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，与蛋白的转录与翻译关系密切。它们在该信号转导通路中起重要调节作用，最终调控细胞周期和细胞凋亡[1]。本研究采用免疫组化SP法检测宫颈鳞癌70例、正常宫颈组织20例中PTEN的表达水平，结合临床病例的分期、肿瘤分级、淋巴结是否转移进行统计学分析来探讨PTEN在宫颈癌发生、发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 标本制定

20例正常宫颈组织、70例宫颈鳞癌组织经10%福尔马林固定，石蜡包埋，切片厚4μm。切片贴在涂有防脱胶的载玻片上，脱蜡至水，切片在作免疫组化染色前先作组织抗原高温高压修复。组织抗原修复主要步骤：将pH值=6.0柠檬酸盐缓冲液置于压力锅加热至沸腾，将脱蜡水化后的组织切片放入沸腾的缓冲液中，高压锅喷气持续1～2min，冷却至室温后取出切片，蒸馏水冲洗3次。

1.2 主要试剂

兔抗人PTEN多克隆抗体，S-P试剂盒均为福州迈新生物技术开发公司产品。抗体工作浓度为1∶50，阴性对照以PBS替代一抗；用已知阳性标本作阳性对照。兔抗mTOR单克隆抗体（克隆号bs-1992R）购于北京博奥森公司。

1.3 实验方法

免疫组化染色采用S-P法，具体实验操作步骤如下：①抗原修复后的组织切片用PBS冲洗，5min×3次；②3%过氧化氢甲醇溶液，孵育10min；③PBS冲洗，5min×3次；④每张切片加50mL非免疫性动物血清，室温下孵育10min后吸去多余的液体；⑤每张切片加50mL的笫一抗体，置于4℃冰箱过夜；⑥PBS冲洗，5min×3次；⑦每张切片加50mL生物素标记的笫二抗体，室温下孵育10min；⑧PBS冲洗，5min ×3次；⑨每张切片加50ml链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液，室温下孵育10min；⑩PBS冲洗，5min×3次；⑾DAB显色；⑿苏木素复染，中性树胶封固。用PBS代替一抗作阴性对照。

1.4 结果判断

表1 mTOR和PTEN在正常宫颈组织和宫颈鳞癌组织中的表达

表2 mTOR 和PTEN表达与宫颈鳞癌临床病理指标的关系

细胞核/浆着色为阳性反应。着色评分标准：不着色0分，浅黄色1分，棕黄色2分，黄褐色3分。每张切片观察500个细胞数，阳性细胞所占比例评分标准：≤5%者0分，6%～25%者1分，26%～50%者2分，＞50%者3分。染色强度评分与阳性细胞评分相加：≤1分为阴性，＞1为阳性。

1.5 统计学分析

采用SPSS13.0统计软件进行分析，计数资料采用χ2检验。

2 结 果

2.1 mTOR和PTEN在正常宫颈组织和宫颈鳞癌组织中表达情况

mTOR和PTEN表达于正常宫颈上皮细胞和宫颈鳞癌细胞的胞质和胞膜，偶见胞核和少量间质着色，镜下可见胞质及胞膜中棕黄色颗粒均匀分布或粗细不等散在分布。mTOR蛋白在正常宫颈组织中表达的阳性率低于宫颈鳞癌组织中表达的阳性率,差异具有显著性（图1-1、图1-2，P＜0.01）。PTEN蛋白在正常宫颈组织中表达的阳性率高于宫颈鳞癌组织中表达的阳性率，差异具有显著性（图2-1、图2-2，P＜0.01）。见表1。

图1 -1 mTOR 在正常宫颈组织中的表达（×400） 图1-2 mTOR 在宫颈鳞癌组织中的表达（×400）

图2 -1 PTEN 在正常宫颈组织中的表达（×400） 图2-2 PTEN 在宫颈鳞癌组织中的表达（×400）

2.2 mTOR和PTEN的表达与宫颈鳞癌各临床病理因素的关系

宫颈鳞癌中mTOR表达的阳性率与临床分期有关（P＜0.01），与淋巴转移、病理分级无关（P＞0.05）。结果中也可见PTEN表达的阳性率与这几种病理因素都无关（P＞0.05），见表2。

2.3 宫颈鳞癌中mTOR和PTEN二者表达的相关性

70例宫颈鳞癌组织中mTOR表达阳性60例，阴性10例。在mTOR表达阳性的组织中PTEN阳性48例，mTOR表达阴性的组织中PTEN阳性1例。PTEN在mTOR阳性组织中的阳性率明显低于在mTOR阴性组织中的阳性率（P＜0.01）。二者的表达成呈显著负相关（P＜0.01）。PTEN的阳性率随mTOR表达阳性的递减。见表3。

表3 mTOR 和PTEN表达的相关性

3 讨 论

雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，从酵母到哺乳动物其广泛存在，且进化十分保守。mTOR是1991年HEITMAN等在分析不同啤酒酵母突变体对雷帕霉素抵抗作用的差别时发现的[1]。mTOR属于磷脂酰肌醇3-激酶相关激酶（phosphatidylinositol 3-kinase-related kinase，PIKK）蛋白家族，在调节细胞生长、增殖、调控细胞周期等多个方面起到重要作用，是肿瘤治疗的一个重要靶点。

PTEN是第10染色体同源丢失磷酸酶-张力蛋白基因，又名MMACI，是1997年发现的一种肿瘤抑制基因，是迄今发现的第一具有双特异性磷酸酶活性的抑癌基因，可通过基因突变、DNA甲基化等方式失活，主要表现为基因缺失、蛋白表达减少[2-3]。PTEN定位于人类染色体10q23.3上，含9个外显子，8个内含子。cDNA序列包含由1209个核苷酸组成的开放阅读框架，编码403个氨基酸组成的蛋白质[4-5]。PTEN基因的突变或缺失导致磷酸酶活性丧失，失去了对细胞增殖的负调控作用，诱导细胞持续增殖，使细胞发生恶性转化。

PI3K/AKT/PTEN/mTOR信号转导通路主要有以下功能：①调控细胞周期，诱导细胞凋亡。②参与肿瘤血管形成。③参与肿瘤细胞的转移和侵袭。mTOR和PTEN是PI3 K/AKT/PTEN/mTOR信号转导通路重要靶点。肺癌、胶质瘤、前列腺癌等多种肿瘤中发现其异常表达[6-8]。

在本研究中mTOR与宫颈癌的发生有关，且在宫颈癌发生的早期即存在，提示mTOR可为宫颈癌的早期诊断、治疗提供一定的帮助。PTEN在宫颈鳞癌组织、正常宫颈组织表达差异有统计学差异，这可能是由于PTEN蛋白的功能缺失使其对肿瘤细胞生长抑制及对细胞黏附的控制减弱，有助于宫颈癌的发生。

mTOR、PTEN基因有可能作为早期筛查宫颈癌的指标应用于临床，来筛查宫颈癌的高危人群，为宫颈癌的早期诊断提供帮助。

[1] Haas-kogan D,Shalev N,Wong M,et al.Protein Kinase B(PKB/ Akt) activity is elevated in glioblastoma cells due tomutation of the tumor suppressor PTEN/MMAC[J].Curr Biol,1998,8(21):1195-1198.

[2] Hriai Y,Tanaka N,Furuta R,et al.Somatic mutations of the PTEN/ MMAC1 gene associated with frquent chromosomal loss detected using comparative genomic hybridiz ation in endometrial cancer [J]. Gynecol Onocol,2001,83(1):81-83.

[3] Nakako S,Hajime T,Masato N.Loss of heterozygosity on 10q23.3 and mutation of the tumor suppressor gene PTEN in beningn endometrial cyst of the ovary: Possible sequence progression from bengin endometrial cyst to endometrial carcinoma and clear cell carcinoma of ovary[J].Cancer Res, 2000,60(18):7052-7056.

[4] Comes CP,Andrade LA.PTEN and p53 expression in primary ovarian carcinomas: immunohistochemical study and discussion of pathogenetic mechanisms[J].Int J Gynecol Cancer, 2006,16(Suppl 1): 254-258.

[5] Hashiguchi Y,Tsuda H,Lnoue T,et al.PTEN expression in clear cell adenocarcinoma of the ovary[J]. Gynecol Oncol,2006,101(1):71-75.

[6] Panagiotou I,Tsiambas E,Lazaris AC,et al.PTEN expression in non small cell lung carcinoma based on digitized image analysis [J].J BUON,2012,17(4):719-723.

[7] Moon SH,Kim DK,Cha Y,et al.PI3K/Akt and Stat3 signaling regulated by PTEN control of the cancer stem cell population,proliferation and senescence in a glioblastoma cell line[J].Int J Oncol, 2013,42(3):921-928.

[8] Zhang W,Haines BB,Efferson C,et al.Evidence of mTOR Activation by an AKT-Independent Mechanism Provides Support for the Combined Treatment of PTEN-Deficient Prostate Tumors with mTOR and AKT Inhibitors[J].Transl Oncol,2012,5(6):422-429.

mTOR and PTEN in Cervical Squamous Cell Carcinoma and Its Significance

LV Shan-qun1, YAO Ting-ting2*, HUANG Nuo-jie1, ZHUANG Min1

(1 Department of Obstetrics and Gynecology, Shantou Central Hospital, Shantou 515031, China; 2 Department of Obstetrics and Gynecology, Sun Yat-sen Memorial Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510120, China)

ObjectiveThe expression of mTOR and PTEN in cervical cancer tissue and their function on occurrence and progress of cervical squamous cancer.MethodsThe expression of mTOR and PTEN in 70 specimens of cervical squamous carcinoma and 20 specimens of normal cervical epithelium were detected by SP immunohistochemistry. Their correlations were analyzed.ResultsThe expression of mTOR on cervical cancer was significantly higher than normal cervical(P＜0.01).The expression of mTOR was correlated with clinical stages（P＜0.01）,but there was no difference with regard to pathological grades and lymph node metastasis（P＞0.05）.The PTEN is lower expressed in cervical cancer tissue than in normal cervical tissue(P＜0.01).The PTEN expression has no relationship with staging,grading and lymphatic metastasis of cervical cancer. The expression of mTOR protein was positively correlated to the expression of PTEN protein.（P＜0.01）.ConclusionThe mTOR and PTEN protein associate with the occurrence of cervical cancer.

Cervical cancer;mTOR; PTEN;SP method

R737.33

B

1671-8194（2013）18-0001-03

国家自然青年基金编号81101979；广东省自然博士启动编号S2011040004639；广东省医学科研基金编号B2011088；中山大学青年教师基金；逸仙优秀医学人才基金

*通讯作者：E-mail：squall41269@21cn.com