李 杰，朱 丹，李 颖，安梦楠，赵秀香，吴元华*

（1.沈阳农业大学植物保护学院，沈阳 110866；2.辽宁省抚顺市农业技术推广中心，辽宁 抚顺 113006）

Sequence-related amplified polymorphism (SRAP)标记技术是一种新型的基于 PCR的显性标记系统[1]，该技术利用独特的双引物对基因的open reading frames（ORFs）特定区域进行扩增，与RAPD、SSR、AFLP等技术相比，SRAP技术具有操作简便、重复性好、信息丰富等优点，特别是对序列信息未知的物种研究提供了快捷简便的途径。该技术已成功用于一些重要性状的标记、基因定位、遗传图谱的构建和抗病基因相关方面研究[2-8]。

本研究室通过人工接种的方法从烟草品种NC89中筛选获得了高抗马铃薯Y病毒脉坏死株系（Potato virus Y-vein necrosis strain，PVYN）的植株（暂定名为SN01），并对该突变株的抗病生理生化机制进行了报道[9]。采用正交试验建立优化的SRAP-PCR反应体系，为进一步研究其抗病基因奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

抗PVYN烟草突变株SN01的嫩叶于2012年7—9月采自沈阳农业大学植物病毒研究室。用于SRAP-PCR反应的dNTPs、Taq DNA聚合酶、标准分子量（Maker）DL2000及新型植物DNA提取试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司，Mg2+溶液和10×PCR buffer（Mg2+free）均购于大连宝生物工程有限公司。SRAP引物由上海生工生物工程公司合成，引物序列见表1。

表1 引物序列Table1 Sequence of primers

1.2 方法

1.2.1 烟草总 DNA的提取和浓度测定 烟草总DNA的提取使用北京天根生化科技有限公司的新型植物DNA提取试剂盒，用美国热电集团生产的NANODROP 1000核酸检测仪检测所提取烟草DNA的浓度与纯度，并通过琼脂糖电泳检测总DNA纯度。将提取到的DNA稀释至30 ng/μL，置于-20 ℃冰箱保存以备使用。

1.2.2 SRAP-PCR反应体系的正交设计 采用L16(45)正交试验设计，对SRAP-PCR反应体系里主要的5个影响因素（dNTPs、Mg2+、Taq DNA聚合酶、引物、DNA模板）设计正交优化试验，所用引物为Me8和Em8（表1）。SRAP-PCR各因素的水平见表2，L16(45)正交试验设计方案见表3。反应总体系为 20 μL，每管加入 2 μL 的 10×PCR buffer（Mg2+free），其他组分加入量见表3，最后用ddH2O补充至 20 μL。

表2 SRAP-PCR反应因素和水平Table2 Factors and levels of SRAP-PCR reaction

表3 SRAP-PCR反应中各因素水平L16(45)正交试验设计Table3 L16(45) orthogonal design of factors and levels for the SRAP-PCR

1.2.3 SRAP-PCR扩增 按照L16(45)正交试验设计16个处理，重复2次。根据表3制备总体积为20 μL的PCR反应体系。反应程序为：94 ℃预变性5 min；前 5 个循环为 94 ℃变性 45 s，34 ℃退火 45 s，72 ℃延伸1 min；后35个循环仅将退火温度变为57 ℃；循环结束后，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。扩增产物用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳观测。

1.2.4 退火温度及循环次数的筛选 在正交试验的基础上，对SRAP反应的退火温度和循环次数进行优化筛选试验。退火温度梯度试验设计 11个梯度处理，即48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58 ℃。在退火温度梯度试验的基础上，进行了循环次数的筛选，设置了9个处理，每个处理重复2次：（1）52 ℃，30循环；（2）55 ℃，30循环；（3）57 ℃，30 循环；（4）52 ℃，35 循环；（5）55 ℃，35 循环；（6）57 ℃，35 循环；（7）52 ℃，40循环；（8）55 ℃，40循环；（9）57 ℃，40循环。

2 结 果

2.1 基因组DNA的提取

基因组提取使用北京天根生化科技有限公司的新型植物DNA提取试剂盒，经核酸检测仪检验结果表明，所提取基因组的OD值为1.8～2.0，并且浓度较高。通过琼脂糖电泳进一步检测（图1），点样孔附近有明显的亮带聚集产生，并且没有拖尾现象，表明所提取的基因组纯度较好，质量较高。

2.2 SRAP-PCR反应体系正交设计的优化

正交试验设计按照表3的16个处理进行SRAP-PCR扩增试验，将得到的扩增产物进行电泳分析（图2），可以看出处理1、2没有条带；处理3、4、5、12、13、14、15、16条带较少，清晰度较差；处理 8、9、10、11的条带较多，且亮度和清晰度较好，其中以处理11效果最好。

图2 正交试验SRAP-PCR产物电泳结果Fig.2 Electrophoresis results of SRAP - PCR product by orthogonal experiment

参照张丽等[10]的统计方法，对 16个组合正交试验结果进行分析（表4），从k值结果可以看出，dNTPs以k3最佳，Mg2+以k3最佳，Taq DNA聚合酶也以k3最佳，引物以k2最佳，模板DNA以k4最佳，即dNTPs 0.4 mmol/L，Mg2+2.0 mmol/L，Taq DNA聚合酶0.8 U，引物0.3 mmol/L，模板DNA 120 ng。该结果与处理11相近，仅在Taq DNA聚合酶水平略有差异，从而认为处理11为最佳组合，即20 μL体系中，最佳加入量分别为：dNTPs（2.5 mmol/L）3.2 μL、Mg2+（25 mmol/L）1.6 μL、Taq DNA聚合酶（2.5 U/μL）0.16 μL、引物（10 μmol/L）0.6 μL、DNA模板120 ng。从R值的结果来看，dNTPs对扩增结果影响最大，Taq DNA聚合酶和引物影响次之，模板DNA和Mg2+影响相比较弱。从扩增结果较好的处理8、9、11看，模板DNA的量分别是30、60、120 ng，表明模板DNA的试用范围较广。

2.3 退火温度及循环次数

退火温度梯度试验设计11个处理即48～58 ℃。从图3中可以看出，退火温度的不同对SRAP扩增条带有较大影响，以处理5（52 ℃）、处理8（55 ℃）和处理10（57 ℃）条带较亮，其中以处理10扩增条带丰富，亮度最佳。

表4 SRAP正交试验结果统计分析Table4 Statistic result of orthogonal experiment

图3 不同退火温度对SRAP-PCR产物电泳结果的影响Fig.3 The electrophoresis results of SRAP - PCR product in different annealing temperatures affect

在对退火温度筛选研究的基础上，对循环次数进行了优化筛选，循环次数由30次增加到40次，设置9个处理，重复2次。从图4中可以看出，循环次数30次条带几乎没有或者不亮，而在35次和40次时条带较好。在不同温度、循环次数相同时比较,温度越高条带越清晰，且扩增条带增多。但在相同温度、不同循环次数比较时，30次和40次时条带较弱或者模糊，35次时条带较亮且多态性较好。从整个电泳结果来看，以处理3结果最好，即退火温度57 ℃，循环次数35次。

3 讨 论

图4 同退火温度和循环次数的SRAP-PCR产物电泳结果Fig.4 Electrophoresis results of SRAP-PCR products with different annealing temperatures and cycles

SRAP-PCR的反应体系不仅受到材料差异的影响，而且引物的不同、试验仪器的不同也会对反应体系造成一定的影响。本试验中试验材料为突变株SN01，为研究突变株SN01的抗病基因，通过引物筛选选用条带清晰且数量较多的引物组合，并在使用此引物的基础上，对SRAP-PCR体系进行优化。PCR反应体系的合适与否直接影响其扩增的结果，目前对 PCR体系优化的方法以正交试验和单因素设计试验较多，正交试验方法可以减少试验次数，缩短试验周期，降低研究成本，可迅速快捷的找到优化的方案。单因素试验可直观快速地明确各因素对PCR的影响，但忽略了各因素间的相互作用[11]。对于PCR产物电泳结果的分析，主要是直观法和统计分析法两种方法评价分析，这两种方法都有一定的主观性，在扩增条带结果统计过程中难免会有人为因素的影响。

在PCR反应中，不同的引物在反应中要求退火温度也有所不同，退火温度过高或者过低都会影响到产物的产量或质量，因此本试验在初步筛选引物后进行了梯度退火实验，并对循环次数进行了筛选，得到了最佳的PCR反应体系。

4 结 论

本研究以烟草抗PVYN突变株SN01为材料，通过正交试验设计对其SRAP的反应体系进行了优化，并且对退火温度和循环次数进行了筛选，得出烟草突变株SN01的SRAP最佳反应体系dNTPs（2.5 mmol/L）3.2 μL、Mg2+（25 mmol/L）1.6 μL、Taq DNA聚合酶（2.5 U/μL）0.16 μL、引物（10 μmol/L）0.6 μL、DNA模板120 ng。SRAP-PCR的最佳反应程序为：94 ℃预变性5 min；前5个循环为94 ℃变性45 s，34 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min；后35个循环将退火温度变为57 ℃；循环结束后，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。该优化体系的建立，为进一步对烟草PVYN突变株SN01的抗病基因研究提供了可靠的基础。

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