彭织云，王敬敬，唐晓阳，潘迎捷，赵 勇

（上海海洋大学食品学院，上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室（上海），上海201306）

由于传统的微生物计数方法费时费力，而分子生物学方法能快速直接地定量微生物的数量，所以运用分子生物学方法检测及定量食品中微生物正逐年增加[1]。运用定量PCR方法检测食源性致病菌的数量已经通过ISO标准（ISO 22174：2005，ISO/TS 20836：2005，ISO 20837：2006，ISO 20838：2006）。目前，已有很多研究利用Real-time qPCR方法对食品样品中的微生物进行定量检测，如Burkhard等[2]运用Real-time qPCR方法定量检测食品中沙门氏菌，Hagi等[3]报道可以运用分子生物学方法监测复杂环境中微生物的生长及活力。运用Real-time qPCR方法只需提取样品DNA，进行Real-time PCR操作即可，整个过程约5h就可得到目的菌株的数量；而传统的涂布计数方法需要通过梯度稀释，再经过选择性培养基的过夜培养，才能得到目的菌株的数量。而且Real-time qPCR方法可以同时检测不同的微生物甚至是活的不可培养的微生物（VBNC）[4]。所以，运用Real-time qPCR方法建立微生物生长预测模型有很大的优势。但是，用分子生物学方法建立微生物生长预测模型还处于初期阶段，在条件的摸索和模型的选择上还需大量的基础研究。本实验就运用Real-time qPCR绝对定量方法对比涂布计数方法建立即食虾中副溶血性弧菌生长预测模型。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

南美白对虾 购自上海浦东新区果园农贸市场；副溶血性弧菌 分离自临床样本；DNA提取试剂盒、克隆试剂盒、质粒提取试剂盒 Tiangen公司；QUANT-IT PICOGREEN DSDNA试剂盒 Invitrogen公司；荧光定量试剂盒 ABI公司；TCBS培养基成分（g/L） 蛋白胨10.0、酵母粉5.0、氯化钠10.0、柠檬酸钠10.0、牛胆汁粉5.0、蔗糖20.0、柠檬酸铁1.0、胆酸钠3.0、硫代硫酸钠10.0、溴麝香草酚蓝0.04、麝草酚蓝0.04、琼脂15.0；3%氯化钠碱性蛋白胨水（APW）成分（g/L） 蛋白胨10.0、氯化钠30.0；均质袋 北京陆桥公司。

高精度恒温培养箱 日本Sanyan公司；BagMixer 400 VW型拍打式均质器 法国Interscience公司；离心机 德国eppendorf公司；7500fast荧光定量仪 ABI公司；Biotek多功能酶标仪 gene公司。

1.2 样品采集和处理

用浸泡接种法将初始菌量为6lg CFU/mL副溶血性弧菌接种到煮熟的南美白对虾（约13g）上，附着0.5h，37℃培养，每隔1h取3只虾放入均质袋中并加入100mL APW均质2min，用生理盐水10倍稀释，在TCBS培养基上涂布并过夜培养。同时收集均质液1mL，12000r/min离心2min收集菌体，-20℃保存。

1.3 质粒标准品构建

1.3.1 采用克隆技术构建目的质粒 tlh正向引物：ACTCAACACAAGAAGAGATCGACAA；tlh反向引物：GATGAGCGGTTGATGTCCAA，用克隆试剂盒克隆成功后挑取阳性克隆继续培养。用质粒试剂盒提取重组质粒，并送测（生工公司）。

1.3.2 质粒标准品绝对定量 用1×TE溶液10倍稀释λDNA标准品，每100μL中加入100μL PicoGreen混匀，建立标准曲线，用Biotek测定质粒浓度。

1.4 DNA的提取和Real-time qPCR

按天根试剂盒说明书提取DNA。Real-time qPCR体系：2×mix（含SYBR Green）10μL、正反引物各1μL、ddH2O 8μL，DNA模板1μL。PCR扩增程序为：50℃2min；95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火1min，40个循环。

1.5 模型建立

运用Origin 8.0软件对两组数据进行拟合，建立Gompertz模型、Logistic模型和Richards模型。Gompertz模型的数学表达式如下：

Logistic模型的数学表达式如下：

Richards模型的数学表达式如下：

式中，N：微生物在时间t时的菌量，CFU/g；N0：t=0时微生物初始菌量，CFU/g；A：N达到最大时对应的lnN/lnN0的值；μmax：最大生长速率，h-1；λ：延滞期。

2 结果与分析

2.1 质粒标准品绝对定量

在NCBI上比对插入序列，确定引物特异性很好。绝对定量标准曲线拟合公式为：Y=0.983X+2.71（R2=0.999），拟合度很好。质粒标准品浓度为29.8ng/μL。根据拷贝数计算公式得到质粒拷贝数为10^9 copies/μL[5]。

2.2 Real-time qPCR标准曲线建立

评价标准曲线的优劣有两个指标，相关系数（R2）和扩增效率（E）。Real-time标准曲线，E为92.011%，R2为0.984。相关系数反映标准曲线的直线性，理想值应大于0.98；PCR理想的扩增效率应在80%到120%之间，本实验结果均符合理想值。

2.3 熟虾中副溶血性弧菌生长模型拟合

通过Origin 8.0软件对实验数据进行拟合。图1为37℃条件下，即食虾中副溶血性弧菌生长曲线的拟合。

图1中的A、B、C图分别是用Gompertz模型、Richard模型和Logistic模型对Real-time qPCR定量方法和传统涂布计数方法所得数据建立37℃条件下副溶血性弧菌的生长预测模型。

表1 三种模型生长参数拟合结果Table 1 The result of the parameters from three models

Real-time qPCR法和涂布计数法均能用Gompertz模型、Logistic模型和Richard模型进行拟合。由Origin软件拟合数据得到副溶血性弧菌在即食虾中的生长参数，结果如表1所示。

通过观察非线性回归的相关系数R2、残差平方和RSS可以比较模型的拟合效果，R2越接近1，残差平方和越小，模型的拟合效果越好[6]。比较表1数据可得，Gompertz模型对Real-time qPCR法所得数据的拟合效果最好，而Richards模型对涂布计数法所得数据的拟合效果最好。

图1 37℃即食虾中副溶血性弧菌生长曲线拟合结果Fig.1 The growth curves of Vibrio parahaemolyticus on ready-to-eat shrimp stored in 37℃

3 结论与讨论

本实验成功构建了检测副溶血性弧菌的质粒标准品，并把Real-time qPCR这种分子生物学的方法运用于建立副溶血性弧菌生长预测模型。传统的涂布计数方法需要选择合适的稀释梯度，并需通过选择性培养基的筛选，而且实验室常用的副溶血性弧菌的选择性培养基硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖琼脂培养基（TCBS）特异性不好，当有其他弧菌存在时就会影响副溶血性弧菌的检出率[7]。相较于传统计数方法，Real-time qPCR定量方法只需提取样品DNA，设计特异性引物，可以同时对多种微生物定量，而且能检测到活的不可培养的菌（VBNC），基于这些优势近年来有很多利用定量PCR方法检测食源性致病菌[8-10]。

Gompertz模型、Logistic模型和Richard模型是常用来拟合微生物S型生长的模型[9]。两组数据均能用这三种模型进行拟合，所得的相关系数均在0.9以上。Real-time qPCR方法所得数据用Gompertz模型拟合的效果最好，而传统的涂布计数法数据用Richards模型拟合效果最好。由于用Real-time qPCR方法建模还处于初期阶段，模型的选择或开发还需进一步研究，一些方法也还需要进一步优化，如DNA提取方法、PCR体系等。Robert-Pillot等[10]提出不同的DNA提取方法影响Q-PCR结果，所以需谨慎选择DNA提取方法。

总结，基于Real-time qPCR的无需培养、速度快、特异性好等优势，运用Real-time qPCR方法建立微生物预测模型将是预测微生物学发展的一种趋势。

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