陈君慧，路 勇，冯 楠，姜 洁，谢文东，江 英，赵俊平，鲁 绯

（1.石河子大学食品学院，新疆石河子832000；2.北京市食品安全监控中心，北京100041；3.北京市食品及酿酒产品质量监督检验一站，北京100075）

类固醇激素和糖皮质激素都属于甾类同化激素。由于其能够促进畜禽生长，提高饲料转化率，有利于蛋白质的沉积，在畜牧业养殖中经常使用。然而，长期摄入同化激素，可导致机体代谢紊乱，发育异常或肿瘤等疾病。上世纪80年代以来，许多国家或组织通过立法限制或禁止在食用性动物饲养中使用同化激素[1]。用于测定食品中激素残留的方法有高效液相色谱法（HPLC）[2-3]、气相-质谱联用法（GCMS）[4-6]和液相-质谱联用法（LC-MS/MS）[5-12]。目前，各国对激素类药物残留的分析精确度和检测要求越来越高，由于HPLC方法的灵敏度较低，选择性和特异性差，已经不适合用于痕量残留分析的要求。GC-MS方法由于需要通过衍生，可达到残留分析的要求，但衍生过程繁琐，耗时耗力。目前，LC-MS/MS已成为检测激素多残留的首选方法，串联质谱的方法可有效提高方法灵敏度、选择性和特异性，能够痕量物质分析的准确性。但目前，激素多残留检测的文献大多是性激素类，而由于类固醇类激素和糖皮质激素选用离子模式不同，对于其同时检测的文献较少，且仪器分析时间较长，影响了分析效率。本研究建立了动物肌肉组织中睾酮、群勃龙及宝丹酮等7种合成类固醇类激素和地塞米松、曲安奈德及曲安西龙等7种糖皮质激素药物残留的超高效液相色谱-串联质谱测定方法，可以满足动物肌肉组织中不同离子模式的激素多残留6min快速、同时分析的检测要求。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甲醇 HPLC级，Fisher公司；甲酸、乙酸铵 HPLC级，CNW technologies公司；甲醇、乙酸乙酯、乙腈、无水硫酸钠 均为分析纯；实验用水 均为超纯水；醇勃龙（10161-33-8，98.2%）、宝丹酮（846-48-0，98.5%）、黄体酮（57-83-0，99.0%）、睾酮（58-22-0，99.5%）、甲睾酮（58-18-4，98.0%）、19-去甲睾酮（434-22-0，99.5%）、美雄酮（72-63-09，98.0%）、可的松（53-06-5，98.5%）、地塞米松（50-02-2，97%）、甲基泼尼松（83-43-2，99.0%）、泼尼松龙（52-21-1，99.2%）、泼尼松（53-03-2，99.0%）、曲安西龙（124-94-7，98.0%）、曲安奈德（76-25-5，98.4%） 德国Dr Ehrenstorfer公司；标准品储备液 分别准确称取0.01g激素类药物标准品于10mL容量瓶中，用甲醇溶解定容，分别配制成1000μg/mL的溶液作为储备液，-20℃以下保存3个月；混合标准工作液 准确量取激素类药物标准贮备液适量，用甲醇溶液稀释成适宜质量浓度的混合标准工作液，现配现用。

XEVO TQS超高效液相色谱-串联质谱仪 美国Waters公司；分析天平 北京赛多利斯有限公司；PL602-L电子天平 上海梅特勒-托利多仪器公司；CQ25-12D超声波清洗器 宁波新芝生物技术股份有限公司；EYEL4旋转蒸发仪 上海爱明仪器有限公司；3-18K冷冻离心机 美国Sigma公司；OASYSTM N-EVAPTM112氮吹仪 美国；超纯水制备仪 美国Milipore公司；Oasis HLB固相萃取柱（6mL，150mg）、Oasis MCX固相萃取柱（6mL，150mg）、固相萃取柱装置 美国Waters公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的提取 准确称取（2±0.05）g动物肌肉组织于50mL聚四氟乙烯离心管中，加20mL乙酸乙酯，漩涡混合振荡2min，超声提取20min，10000r/min离心10min，移取乙酸乙酯层。于残渣中加入10mL乙酸乙酯，重复上述操作，合并两次提取液，35℃旋转蒸至近干，加5mL 30%甲醇水溶解残渣，待净化。

1.2.2 样品的净化 移取提取液，上样于已活化的Oasis HLB固相萃取柱（预先用5mL甲醇与5mL水活化），待滤液全部流出小柱后，弃去滤液。再用5mL水、5mL甲醇-水（1∶1，v/v）以2～3mL/min流速淋洗萃取柱，抽干，弃去流出液。用5mL甲醇-乙腈洗脱液（1∶1，v/v）洗脱，收集置于刻度试管中，洗脱液于50℃氮气吹干。用1mL乙腈-水（1∶1，v/v）溶液溶解残渣并定容，0.22μm聚四氟乙烯过滤器过滤，供液相色谱-串联质谱仪测定。

1.2.3 液相色谱条件 色谱柱：Waters ACQUITY HSS T3（1.8μm，2.1mm×50mm）；流动相：甲醇（A）和5mmol乙酸铵0.1%甲酸水溶液（B）；柱温：40℃；进样量：10μL，梯度洗脱条件见表1。

表1 色谱分离梯度洗脱条件Table 1 UPLC gradient elution conditions

1.2.4 质谱条件 电喷雾离子源，毛细管电压：3.2kV（ESI+）、2.5kV（ESI-）；锥孔电压：50V，离子源温度：150℃，脱溶剂温度：350℃，去溶剂气流量：900L/Hr，碰撞腔真空度：700kPa，监测模式：多反应监测（MRM）。14种激素质谱条件参数见表2。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

实验选用串联质谱多反应监测模式（MRM）采集信号，采用正负离子切换的方式，以100μg/kg的激素混合标准溶液自动调谐，在ESI+模式下，7种类固醇类激素可以形成[M+H]+分子离子峰，在ESI-模式下，7种糖皮质激素可以形成 [M+HCOO]-分子离子峰，然后进行相应的子离子扫描，确定特征子离子，14种激素的质谱优化参数见表2。

2.2 液相色谱条件的选择

2.2.1 色谱柱的选择 本研究中同为甾体激素药物的7种类固醇激素与7种糖皮质激素的结构主要是由碳、氢及氧组成的中性化合物，极性较小。目前，甾体激素类药物常用的液相色谱柱为C18色谱柱。实验考查了不同型号色谱柱（BEH C18与HSS T3）及不同长短色谱柱对色谱分离效果的影响，实验表明，50mm的色谱柱可满足14种激素检测分离的要求；因HSS T3耐受的pH范围较宽，且耐受纯水相等特点，与BEH C18相比，可改善目标化合物的色谱峰形，达到标准物质在色谱柱有较强保留的效果，因此，通过以上因素的考查，选定ACQUITY HSS T3为最佳色谱柱。

2.2.2 流动相的选择 考虑糖皮质激素在电离过程中，在ESI-电离模式下需要产生[M＋HCOO]-分子离子峰，即选择[M＋HCOO]-作为碰撞诱导解离的母离子，才可获得较高丰度的[M＋HCOO]-分子离子峰，因此，在流动相中加入了适量的甲酸以提供其加和离子+HCOO的需求。实验比较了有机溶剂乙腈或甲醇（A相）与甲酸水溶液或乙酸铵甲酸缓冲液（B相）分离激素的效果，通过比较发现，在甲醇-乙酸铵甲酸缓冲液流动体系，采用梯度洗脱程序，14种激素药物在6min内分离效果较好，响应较高，且峰形对称，不拖尾、不前延，14种激素药物10μg/kg混合标准溶液MRM离子流色谱图见图1，图2为空白鸡肉基质中添加浓度为5μg/kg时的各通道提取的相应标准品的定量离子流色谱图。

表2 14种激素质谱分析条件参数Table 2 MS parameters for the analysis of 14 hormones

2.3 样品前处理条件的优化

2.3.1 提取溶剂的选择 实验中14种甾体同化激素较易溶解于极性溶剂中，因此，考察了甲醇、乙腈及乙酸乙酯3种不同提取溶剂对回收率的影响。结果表明，甲醇的提取效果较差，14种甾体同化激素的平均回收率在45.5%左右，且提取杂质较多，不易净化；而乙腈与乙酸乙酯相比，两者提取效果相当，平均回收率在70.8%以上，因乙酸乙酯较易浓缩，故选取乙酸乙酯作为提取溶液，可以满足动物肌肉组织中14种激素的提取要求。

2.3.2 固相萃取柱的选择 因甾体同化激素的残留量较低，而动物肌肉组织中的干扰物较多，因此，本研究采用固相萃取柱净化。实验考查了通用型较强的HLB柱与强阳离子MCX柱的净化效果，结果表明，HLB柱的效果较好，14种激素的平均回收率在80%以上；MCX柱对7种类固醇类激素的净化效果相对较好，平均回收率在75%左右，而对7种糖皮质激素的净化效果较差，只有15%左右。因此，选取HLB柱作为净化固相萃取柱。

2.3.3 固相萃取洗脱溶液的选择 实验考查了甲醇、乙腈、甲醇-乙腈（1/1，v/v）对激素药物的洗脱能力，结果显示，甲醇洗脱时，其平均回收率在51.8%～81.9%之间，乙腈洗脱时，其平均回收率在60.8%～82.8%之间，甲醇-乙腈（1/1，v/v）洗脱时，平均回收率在78.9%～90.5%之间。因此，可看出，甲醇-乙腈（1/1，v/v）的洗脱能力最强，乙腈的洗脱能力略高于甲醇，故选取甲醇-乙腈（1/1，v/v）作为洗脱溶剂。

2.3.4 样品溶解液的选择 实验考察了甲醇-5mmol乙酸铵0.1%甲酸水溶液（1/9，v/v）与乙腈-水（1/1，v/v）溶解溶液，甲醇-5mmol乙酸铵0.1%甲酸水溶液（1/9，v/v）溶解时，黄体酮与地塞米松的平均回收率低于40%，其余12种激素药物的平均回收率在80%左右。而乙腈-水溶解时，可达到14种激素药物全部溶解，且平均回收率在85%以上，因此，选用乙腈-水（1/1，v/v）作为样品溶解液。

2.4 方法学考察

2.4.1 标准曲线及检出限 空白鸡肉试样按照前处理方法进行样品前处理，并加入不同浓度的14种激素标样混合溶液（0.5、1、2、5、8、10、20、50μg/kg），处理后进样，以待测物色谱图的峰面积为纵坐标，相应待测物质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，其回归方程和线性相关系数见表3。结果表明，本方法在0.5～50μg/kg范围呈良好线性关系，线性相关系数r均大于0.99，以3倍信噪比计算其方法检出限（LOD）在0.3～1.0μg/kg之间。

图1 14种激素的MRM离子流图（10μg/kg）Fig.1 Multiple reaction monitoring chromatograms of 14 hormones（10μg/kg）

图2 空白基质中添加5.0μg/kg激素药物的MRM离子流图Fig.2 MRM chromatograms of a blank animal fortified with 14 hormones at 5.0μg/kg for each

2.4.2 方法回收率与精密度 在空白鸡肉试样中添加低、中、高（2、5、10μg/kg）3个不同浓度水平的14种激素药物混合标准溶液，进行前处理，测定目标化合物，进行回收率实验，并考察实验方法的精密度，结果见表4。每个浓度水平进行6次平行实验，14种激素药物的平均回收率为72.48%～114.52%，相对标准偏差为3.93%～11.17%。

表3 14种激素的线性方程、线性范围、相关系数和检出限Table 3 Regression equations,limits of determination and limits of quantification of 14 hormones

3 结论

本文建立了超高效液相色谱-串联质谱（UPLCMS/MS）法同时检测动物肌肉组织中的类固醇类激素和糖皮质激素残留的分析方法。试样前处理方法灵敏度高，精密度好，特异性强，检测速度快，回收率高且稳定；同时，利用电喷雾正负离子同时扫描检测的技术，可以满足动物肌肉组织中不同离子模式的激素多残留分析同时检测要求。

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表4 不同添加水平回收率和精密度实验结果（n=6）Table 4 Results of recovery and precision tests（n=6）

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