张 媛 徐 红 杨汝春 周法根（指导） 浙江中医药大学附属广兴医院 杭州 310007

侯小青 浙江中医药大学

·实验研究·

复方芪苓无糖颗粒对高脂致血管内皮细胞损伤的保护作用

张 媛 徐 红 杨汝春 周法根（指导） 浙江中医药大学附属广兴医院 杭州 310007

侯小青 浙江中医药大学

目的：观察复方芪苓无糖颗粒对高脂损伤血管内皮细胞的保护作用，探讨其治疗高脂血症的作用机制。方法：用高脂血清造成人血管内皮细胞（EVC）损伤模型，以复方芪苓无糖颗粒及血脂康含药血清进行干预。光镜下观察细胞形态变化，MTT法检测细胞活性；采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测复方芪苓无糖颗粒高、中、低剂量各组对高脂血清诱导的血管内皮细胞表面黏附分子（TGF-β1）基因表达。结果：复方芪苓无糖颗粒各剂量组及血脂康组均能使高脂损伤的EVC形态趋于正常，活性增强，细胞膜损伤减轻；并均有上调内皮细胞TGF-β1的趋势，血脂康组TGF-β1表达与复方芪苓颗粒中、高浓度组比较无统计学意义（P＞0.05）。结论：复方芪苓无糖颗粒对高脂损伤的血管内皮细胞有保护作用，可能是其防治高脂血症及动脉粥样硬化的作用机制之一。

血管内皮细胞损伤 高脂血症 复方芪苓无糖颗粒 转化生长因子-β1

动脉粥样硬化发病机制复杂，诸多因素参与，血管内皮细胞损伤作为始动环节已被公认。本研究以高脂血清造成人血管内皮细胞（EVC）损伤模型，以复方芪苓无糖颗粒及血脂康含药血清进行干预，观察复方芪苓无糖颗粒对内皮细胞的保护作用及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 复方芪苓无糖颗粒（组成：黄芪、土茯苓、丹参、秦艽等；功效：健脾化痰，益气活血）由杭州市中医院制剂室提供；血脂康胶囊由北京北大维信生物科技有限公司生产；胰蛋白酶由GIBCO公司杭州吉诺生物公司分装；M199培养液、胎牛血清、PBS缓冲液由杭州四季青公司提供；MTT、DMSO由美国SIGMA公司生产杭州达文生物公司分装；Trizol试剂盒、10×PCR buffer、Taq酶、DNTP Mix、ICAM-1引物序列、TGF-β1引物序列、β-actin引物序列由上海生工生物有限公司提供。

1.2动物与细胞 清洁级成年雄性SD大鼠，体质量（160g±20）g，由浙江中医药大学实验动物中心提供，许可证编号：SYXK（浙）2008-0115。细胞株由浙江中医药大学提供。

1.3 血清制备 成年雄性SD大鼠20只，常规饲养1周后随机分正常组、高脂组、复方芪苓颗粒组和血脂康组，每组5只。正常组大鼠予标准饲料，高脂组、复方芪苓颗粒组、血脂康组按高脂饲料配方（猪油15%+胆固醇6%+胆盐3号2%+丙基硫氧嘧啶0.2%），10mL/kg的容量灌胃，每天1次（12：00）。第19天起复方芪苓颗粒组、血脂康组在灌高脂饲料的同时灌胃给药，每天灌胃量分别为1.6g、0.25g，2mL/次，每天8、16时灌胃，共3天。各组大鼠连续灌胃21天，灌胃期间高脂组和药物组大鼠自由摄取常规饲料，末次灌胃后1h从腹主动脉取血。离心后各取血清0.5mL送检，检测血脂水平，剩余血清超滤，56℃水浴灭活30min，-80℃冰箱保存备用。

1.4 细胞培养 用胶原酶消化法分离人血管内皮细胞；加6mL含10%FCS的M199培养液将细胞打匀，转移至培养瓶中培养。吸净培养液，用PBS冲洗1次，每瓶加入1mL10倍胰酶、3mL PBS；37℃、消化5～7min，用指尖轻叩瓶底，以细胞脱落瓶底为宜，加入含10%FCS的M199终止消化；用吸管将细胞充分吹打下来，转移至15mL离心管，4℃、1 000转离心5min；去上清，加入M199液洗涤1次，离心；去上清后，加入含10%FCS M199培养液10mL，吹打成细胞悬液，各取5mL分别加入50mL培养瓶中，置37℃、5%CO2培养箱中孵育，2天换液1次，待细胞长到90%融合时传代培养。实验取第六代细胞。

1.5 实验分组 将接种细胞随机分为正常对照组（10%正常大鼠血清）、高脂组（10%高脂大鼠血清）、复方芪苓无糖颗粒低浓度组（7.5%高脂血清和2.5%复方芪苓颗粒血清）、复方芪苓无糖颗粒中浓度组（5%高脂血清和5%复方芪苓颗粒血清）、复方芪苓无糖颗粒高浓度组（10%复方芪苓颗粒血清）、血脂康组（5%高脂血清和5%血脂康血清），每组设6个平行孔。

1.6 检测指标

1.6.1 EVC形态学观察 各组药物血清作用呈单层EVC 24h后，倒置显微镜下观察EVC形态变化。

1.6.2 MTT法检测细胞增殖 将80%融合生长的内皮细胞以10倍胰酶消化，收集细胞，含10%FCS的M199培养液稀释后以2×104/L的密度接种于96孔板。正常培养24h后，洗去未贴壁细胞。换用无血清的M199培养液继续培养24h，使细胞同步化。同步24h后换用含不同浓度高脂血清的M199培养液，即低浓度高脂血清刺激组：用7.5%正常大鼠血清和2.5%高脂血清的M199培养液培养；中浓度高脂血清刺激组：用5%正常大鼠血清和5%高脂血清的M199培养液培养；高浓度高脂血清刺激组：用10%高脂血清的M199培养液培养。并设空白对照组（含10%正常大鼠血清的M199培养基）及调零孔（10%胎牛血清培养基、MTT、DMSO）。分别培养24h、48h后移出培养液，换入无血清M199培养液100μL/孔，并于每孔加MTT（5g/L）10μL。继续培养4h后，吸弃原培养液，每孔中加入DMSO100μL，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解，并于酶联免疫检测仪490nm波长处检测光密度值（OD值）。

1.6.3 逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测TGF-β 1基因表达 依照Trizol试剂盒说明书提取总RNA，根据康为逆转录试剂盒说明书进行逆转录，用逆转录后的cDNA产物做模板扩增TGF-β1产物。取PCR产物10μL，加入10×Loading Buffer 2μL，混匀后加到凝胶孔中，将电泳仪电压调至80伏，电泳15～20min，用凝胶成像系统采集图像，用 Bio Rad quan⁃ity one软件对条带进行半定量分析,TGF-β1 mRNA的相对含量分别用其与β-actin特异性条带的积分光密度比值表示。每组实验重复3次。

1.7 统计学方法 应用SPSS16.0统计软件进行统计分析，数据以（±s）表示，采用单因素方差分析（ANOVA），组间用LSD法做比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 复方芪苓无糖颗粒及血脂康对高脂血清处理的EVC形态学的影响 正常对照组细胞相差显微镜下为单层，互不重叠呈铺石灰镶嵌排列，细胞呈多角型，边界清楚；高脂组细胞间隙增宽，细胞收缩变圆，细胞边界不清，部分细胞脱落；复方芪苓及血脂康干预组细胞间隙变窄，形态趋于正常。

2.2 高脂血清对血管内皮细胞增殖的影响 48h各浓度高脂血清刺激组与空白对照组比较，OD值无明显变化（P＞0.05）；24h各浓度高脂血清刺激组与空白对照组比较，OD值明显增加（P＜0.05）；高浓度组OD值增加最明显，与低、中浓度组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 高脂血清对血管内皮细胞增殖的影响（±s）

表1 高脂血清对血管内皮细胞增殖的影响（±s）

注：与空白对照组比较，▲P＜0.05；与低、中浓度组比较，△P＜0.05

组别空白对照组低浓度高脂血清刺激组中浓度高脂血清刺激组高浓度高脂血清刺激组n5555 24h 1.45±0.03 1.48±0.09▲1.43±0.19▲1.76±0.11▲△48h 1.61±0.04 1.60±0.06 1.64±0.07 1.58±0.20

2.3 复方芪苓颗粒对高脂血清诱导的内皮细胞TGF-β1mRNA表达的影响 高脂组与正常对照组比较TGF-β1显著降低（P＜0.05）；复方芪苓颗粒低、中、高浓度组、血脂康组均有上调内皮细胞TGF-β1的趋势，中、高浓度组与高脂组比较，TGF-β1显著升高（P＜0.05）；血脂康组能显著上调内皮细胞TGF-β 1的含量（P＜0.05），见表2。

表2 复方芪苓颗粒对内皮细胞TGF-β1 mRNA的影响（±s）

表2 复方芪苓颗粒对内皮细胞TGF-β1 mRNA的影响（±s）

注：与正常对照组比较，▲P＜0.05；与高脂组比较，*P＜0.05

n TGF-β1/β-actin组别333333 0.18±0.03 0.08±0.03▲0.11±0.07▲0.23±0.05▲* 0.25±0.05▲* 0.23±0.08▲*正常对照组高脂组复方芪苓颗粒低浓度组复方芪苓颗粒中浓度组复方芪苓颗粒高浓度组血脂康组

3 讨 论

已有研究证明，复方芪苓颗粒能显著降低高脂血症大鼠TC、TG及LDL-C，提高HDL-C[1]；复方芪苓颗粒含药血清能显著抑制TNF-α刺激血管内皮细胞 ICAM-1 mRNA的表达 ，从基因水平阐明了复方芪苓颗粒对TNF-α诱导内皮细胞ICAM-1 mRNA的表达的抑制作用,从体外实验证明复方芪苓颗粒含药血清抑制 ICAM-1表达的作用是减轻 TNF-α诱导的人血管内皮细胞炎症损伤的机制之一[2]。本实验以高脂血清作用于EVC，造成内皮细胞损伤模型，光镜下可见细胞间隙增宽，细胞收缩变圆，细胞边界不清，部分细胞脱落；而复方芪苓无糖颗粒各剂量组及血脂康组可以使高脂血清造成的细胞形态学改变趋于正常。MTT比色法测定EVC活性结果表明，高脂血清明显抑制EVC的活性。TGF-β1是TGF-β众多成员中的一种，在哺乳动物体细胞中所含的比例最高（＞90%）、活性最强，与疾病关系最密切。目前普遍认为TGF-β1是AS的保护性细胞因子。研究[3]表明，TGF-β1在心血管方面的主要生物作用有：①对血管内皮细胞的迁移及增殖呈促进或抑制的双相性；②调节细胞外基质蛋白，增加纤维连接蛋白、蛋白聚糖和胶原蛋白合成，阻止基质蛋白降解。所以，TGF-β1在动脉硬化过程中作用是双向性的，既抑制动脉粥样斑块又有参与再狭窄的可能。本实验结果显示，复方芪苓无糖颗粒中、高浓度干预组TGF-β1较高脂组均有显著提高，提示中药复方芪苓无糖颗粒可能通过提高内皮细胞TGF-β1的含量降低高脂环境下巨噬细胞的表达，从而降低清道夫受体的表达，使胆固醇成分减少，上调ATP结合转运载体使胆固醇外流增加，同时抑制由氧化的极低密度脂蛋白残基诱发的泡沫细胞的形成，起到抗粥样硬化的作用。

［1］徐红，张媛，杨汝春，等.复方芪苓无糖颗粒剂对高脂血症大鼠脂质代谢紊乱调节的研究［J］.中华中医药杂志，2012，27（11）：2982-2985.

［2］徐红，杨汝春，王军，等.尿酸利仙含药血清对TNF-α诱导的人血管内皮细胞ICAM-1基因表达的影响［J］.中医药学刊，2006.8，24（8）：1451.

［3］郑琼莉，祝炜，贾晶，等.转化生长因子β1与心血管疾病［J］.中国心血管病研究志杂，2006，4（7）：550-551.

ProtectiveEffectsofSugar-freeQilingCompoundGranulesonEndothelialVascularCellsAgainstInju⁃riesInducedbyHyperlipidemicSerum

Z HANGY u a n,XUH o n g,HOU X i a o-q i n g,e t a l.G u a n g x i n g H o s p i t a l Affiliated to Zhejiang Traditional Chinese Medicine University,Hangzhou(310007)，China

Objective:To study the protective effect of sugar-free Qiling compound granules on endothelial vascu⁃lar cells(EVC)against injuries by hyperlipidemic serum,in an attempt to understand the underlying mechanism of sugar-free Qiling compound granules in treating hyperlipidemia.M ethods:Hyperlipidemic serum was used to establish injured model of EVC.Sera with sugar-free Qiling compound granules of low,medium,high concentra⁃tions and Xuezhikang were applied with hyperlipidemic serum together.The morphologic changes of EVC were ob⁃served under light microscope and EVC activity was determined by MTT method.Reverse transcription-poly⁃merase chain reaction(RT-PCR)technique was used to detect hyperlipidemia induced EVC surface adhesion mole⁃cule(TGF-β1)gene expression in 3 Qiling groups.Results:After treatment of 3 doses of Qiling compound and Xuezhikang,abnormal morphologic changes of EVC induced by hyperlipidemic serum gradually retained to nor⁃mal,the activity of EVC increased,and the injury of cell membrane lessened.The mRNA’s expression of TGF-β 1 in all groups increased after treatment and the expression was not statistically different between the Xuezhi⁃kang group and the sugar-free Qiling groups with medium and high concentrations(P＞0.05).Conclusion:Sug⁃ar-free Qiling compound granules have a protective effect on EVC against injuries induced by hyperlipidemic se⁃rum and can be used as prevention and treatment for hyperlipidemia and atherosclerosis ideal medication.

endothelial vascular cell injury hyperlipidemia sugar-free Qiling compound granules transforming growth factor-β1

2012-10-25

浙江省中医药科研计划项目（No.2008CA080）

张媛，E-mail：xiamo0405@msn.com.