付 莉，宋建新，岳喜庆

（1.辽宁医学院食品学院，辽宁锦州121001；2.沈阳农业大学食品学院，辽宁沈阳110161）

母乳是适合婴儿生长发育的最完美的食物。但是，有的母亲因为个人、文化、社会经济和健康等原因选择人工哺乳。当母乳缺乏时，牛乳因其来源广泛、与母乳成分较为接近而常被用来作为母乳的替代品。而牛乳与人乳蛋白质含量与成分的差异是牛乳不适症产生的主要原因。经研究表明，引起婴儿过敏的蛋白质主要为αs-酪蛋白、α-乳白蛋白及β-乳球蛋白。目前，牛乳蛋白质致敏性降低的方法主要有超滤、物理处理、生物转化、酶水解，而由于酶水解后苦味较低，省时，经济，有功能新肽的产生而被广泛研究[1-2]。利用酶法降低牛乳蛋白致敏性，酶的类型，酶的水解条件对产物的分子量、抗原性、苦味程度都有很大的影响，Ena J M等[3]研究表明，肽分子量低于3400u就不会引起过敏反应，Beresteijn等[4]研究表明，肽分子量在3000～5000u可诱导免疫反应。大量研究显示，降低牛乳蛋白质致敏性的研究多集中于单一的酪蛋白或乳清蛋白，因此本研究尝试以牛乳为研究对象，基于降低牛乳蛋白抗原性获得低苦味程度的牛乳蛋白水解物为目的，利用单酶或混合酶处理牛乳，为低致敏性婴儿配方乳的研制打下前期基础。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

新鲜牛乳 锦州市售（主要成分蛋白质3.2%、脂肪3.6%、乳糖4.5%、水分88%、灰分0.70%）；胰蛋白酶（18380.23U/g）、风味蛋白酶（15285.71U/g）、胃蛋白酶（6230U/g）、碱性蛋白酶（18761.90U/g）、中性蛋白酶（13847.19U/g）、木瓜蛋白酶（15285.71U/g） 购于天津诺奥科技酶制剂公司；低分子量标准蛋白（97400～14400u） 购于上海生物化学研究所；茚三酮、果糖、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钾、浓硫酸、碳酸钠、邻苯二胺二盐酸、邻苯二胺、明胶、吐温、无水乙醇、30%H2O2均为分析纯；乙睛、三氟乙酸 为色谱纯；αs-酪蛋白、β-乳球蛋白、羊抗兔IgG-HRP、α-乳白蛋白、牛血清白蛋白（66ku）、胰蛋白酶抑制剂（31ku）、溶菌酶（14.4ku）、抑肽酶（6.5ku）、胰岛素b（3.5ku）、人血管紧张肽II（1040u）购于Sigma公司。

SHA-B型恒温水浴振荡器 江苏金坛市宏华仪器厂；SP-752型紫外可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司；DYY-6C型电泳仪、DYCZ-24B型电泳槽 北京六一仪器厂；9018型96孔酶标板 Corning Costar公司；Thermo Multiskan MK3酶标仪 Thermo Electron公司；快速蛋白质色谱仪 Pharmacia公司，色谱柱为Superdex-75 HR 10/30柱；FD-1B-80型真空冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 牛乳蛋白水解工艺 将新鲜牛乳，预热10min，分别加入0.4%风味蛋白酶反应60min，0.8%胰蛋白酶反应60min，先加入0.8%胰蛋白酶40min、再加入0.4%风味蛋白酶20min，通过不断加入0.5%的氢氧化钠维持体系pH8.0，55℃振荡60min，反应过程中每隔10min取水解液并放入90℃水浴灭酶10min，冷却，取原乳和水解液稀释，利用茚三酮比色法测定牛乳蛋白的水解度。90℃水浴灭酶10min灭酶后的水解液，5000r/min离心10min，取上清，冻干，-20℃保存，用于液相色谱分析。

式中，DH：水解度（%）；h：水解后每克蛋白被裂解的肽键毫摩尔数（mmol）；htot：每克原料蛋白质的肽键毫摩尔数（mmol）；N×F：全脂乳蛋白质含量（g/L）；[-NH2]水解液：水解液的-NH2的含量（mmol/L）；[-NH2]原料：原料乳的-NH2的含量（mmol/L）；8.3：mmol/g。

1.2.2 水解液的SDS-PAGE分析 用5%浓缩胶和15%分离胶，样品于浓缩胶中在80V电压下运行1h，于分离胶中在120V电压下运行3h。用0.05%（W/V）（醋酸∶醇∶水=1∶5∶5）考马斯亮蓝R250染色45min，然后放入脱色液（醋酸∶甲醇∶水=3∶2∶40）中脱色，以低分子量Marker标准为参比，得到所需蛋白条带分子。上样量均为15μL。

1.2.3 水解液的快速蛋白质液相色谱分析 水解液冻干粉（1mg/mL）溶解在含有0.15mol/L氯化钠，0.05mol/L磷酸盐pH7.0缓冲液中，样品经0.22μm膜过滤，上样量为100μL，洗脱速度为0.25mL/min，检测器波长为280nm。柱子先用以下各标准品平衡，牛血清白蛋白（66ku）、胰蛋白酶抑制剂（31ku）、溶菌酶（14.4ku）、抑肽酶（6.5ku）、胰岛素b（3.5ku）、人血管紧张肽II（1040u）。

1.2.4 多克隆抗体的制备及样品抗原性测定[5]

1.2.4.1 克隆抗体的制备 选取8周龄健康日本大白兔6只，分三组，喂养不含乳蛋白的饲料。每组分别皮下多点注射αs-酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和等体积混合的弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂，每只兔子免疫剂量为2mg/mL，每隔两周免疫1次，免疫4次。每次免疫前，耳缘静脉取血后，采用双向免疫扩散法测定抗血清的效价。效价合格后，动脉取血，37℃放置1h凝血后，4℃冰箱放置过夜，4000r/min离心3min分离血清，-20℃冻存备用。

1.2.4.2 抗原测定 间接竞争Elisa法[6]。

1.2.4.3 抗原包被 用包被液将α-乳白蛋白稀释为2.5μg/mL，β-乳球蛋白稀释为1.0μg/mL，αs-酪蛋白稀释为1.0μg/mL，分别取100μL加入96孔酶标板中，4℃过夜。

1.2.4.4 抗原与抗体预混 反应管中加入稀释后待测样品和等体积稀释后的抗血清。同时一个反应管中只放抗血清不加样品为无竞争管。4℃冰箱放置过夜。

1.2.4.5 洗涤 次日恢复至室温，倾去孔内液体，每孔加入300μL PBST洗涤4次，每次3min，于干净吸水纸上拍干。

1.2.4.6 封闭 每孔加入100μL 1.5%明胶，37℃保温1h，恢复至室温，倾去封闭液，PBST洗涤4次，每次3min，于干净吸水纸上拍干。

1.2.4.7 抗原抗体反应 将抗原抗体预混液100μL加入酶标板中，置于湿盒中，37℃培养1h。反应结束后，倾去孔内液体，PBST洗涤4次，每次3min，于干净吸水纸上拍干。

1.2.4.8 加酶标抗抗体 每孔加入100μL 1∶5000稀释后的HRP-羊抗兔IgG，置于湿盒中，37℃培养1h，反应结束后，倾去孔内液体，PBST洗涤4次，每次3min，于干净吸水纸上拍干。

1.2.4.9 显色 每孔加入100μL HRP底物溶液，置于湿盒中，37℃培养20min，显示黄色。

1.2.4.10 终止反应 每孔加入50μL 2mol/L H2SO4，终止反应。

1.2.4.11 比色 用酶联免疫检测仪在490nm测定每孔液体吸光值。

1.2.4.12 抗原降低率计算 抗原降低率（%）=（A样品-A原乳/A无竞争-A原乳）×100

2 结果与讨论

2.1 水解用酶的筛选

牛乳中分别加入0.1%的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶，分别于37、55、55、50、50、37℃水解60min，综合水解度、苦味程度、色泽、状态，筛选出水解效果较好的蛋白酶。

表1显示综合水解度、苦味程度、色泽、状态变化考虑，同等条件下采用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶水解牛乳蛋白效果较好。胰蛋白酶是内切蛋白酶，可特异性水解连接赖氨酸和精氨酸羧基的肽键。因此产生的疏水肽较少，使苦味降低[7]。风味蛋白酶含有外切和内切蛋白酶活性，通过内切蛋白酶切断多肽内部的肽键，形成短链肽，其中一些含有疏水氨基酸而呈苦味肽，使用外切酶从苦味肽末端切断释放氨基酸，从而把苦味肽彻底降解为氨基酸，可有效降低水解度产物的苦味，增进和改善水解液的风味。但是牛乳经木瓜蛋白酶水解后分层严重且苦味较重，不适合后期配制婴儿配方乳，而牛乳经胰蛋白酶和风味蛋白酶水解后，水解度最高，且苦味较小，因此本实验选定胰蛋白酶、风味蛋白酶为水解用酶进行后续研究。

表1 不同蛋白酶对牛乳蛋白水解度的影响Table 1 Effect of different proteases on milk protein hydrolysis degree

2.2 反应时间与水解度之间关系

图1 各种酶水解度与时间关系图Fig.1 The relationship between DH and time

图1显示了牛乳在不同酶水解条件下水解度随时间的变化情况，胰蛋白酶、风味蛋白酶及两种酶分阶段水解的前40min，水解度增长速度较快，而40min后水解度增长较缓慢。其中胰蛋白酶和风味蛋白酶分阶段水解效果好于两种酶单独水解。风味蛋白酶属于内外切混合酶，胰蛋白酶属于内切酶，先加入胰蛋白酶使蛋白质产生大量短肽，然后再加风味蛋白酶水解短肽，这种水解方式的效果更好，所以导致两种酶分阶段水解效果较好[8]。水解60min后，胰蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶和风味蛋白酶分段水解后水解度分别达到24.6%、20%、26%。Svenning指出蛋白质水解程度不应该过大，否则会使终产品太苦而口感不好，且产生大量自由氨基酸不如小肽更容易被人体吸收[9]，因此，这样的水解效果对产品而言是可以接受的。

2.3 不同反应时间内αs-酪蛋白抗原性的变化

图2显示了随着水解时间的增加，风味蛋白酶水解液中αs-酪蛋白抗原性降低率逐渐增加，胰蛋白酶水解液中αs-酪蛋白的抗原降低率先增加后减少而后又增加。胰蛋白酶和风味蛋白酶分步水解液的αs-酪蛋白抗原降低率也是先增加后减少而后又增加。主要原因是αs-酪蛋白有过敏表位，随着胰蛋白酶水解的进行，有的过敏表位被水解掉，但同时又有些隐藏在内部的过敏表位又暴露出来，反而增强了其抗原性。水解前40min各组蛋白酶水解液αs-酪蛋白抗原降低较快，40min后αs-酪蛋白抗原降低较慢。水解60min后，胰蛋白酶、风味蛋白酶、风味蛋白酶和胰蛋白酶分步水解液的抗原降低率分别达到83%、93%、96%。

图2 酶水解时间与酪蛋白抗原降低率关系图Fig.2 The relationship between time and antigen lower rate

2.4 不同反应时间内α-乳白蛋白抗原性的变化

图3 酶水解时间与α-乳白蛋白抗原降低率关系图Fig.3 The relationship between time and antigen lower rate of α-lactalbumin

图3显示了随着水解时间的增加，三组蛋白酶水解液的α-乳白蛋白抗原降低率均逐渐增加，水解前40min抗原降低较快，而40min后抗原降低率趋于平缓。水解60min后，胰蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶和风味蛋白酶水解产物中α-乳白蛋白抗原性降低率分别达到91%、93%、96%。α-乳白蛋白的抗原性较β-乳球蛋白易于去除，Ena研究结果一致[10]。

2.5 不同反应时间内β-乳球蛋白抗原性的变化

图4显示了随着水解时间的增加，胰蛋白酶和风味蛋白酶水解液β-乳球蛋白的抗原降低率逐渐减少，水解前40min抗原降低较快，而40min后抗原降低趋于平缓。而胰蛋白酶水解40min后加入风味蛋白酶，β-乳球蛋白的抗原降低率升高较快。水解60min后，三组蛋白酶水解也中β-乳球蛋白抗原性降低率分别达到13%、55%、71%。胰蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶和风味蛋白酶水解液蛋白抗原降低率相比，β-乳球蛋白对蛋白酶的抵抗能力较强，抗原性下降相对较低。

图4 酶水解时间与β-乳球蛋白抗原降低率关系图Fig.4 The relationship between time and antigen lower rate of β-lactoglobulin

2.6 水解液的SDS-PAGE分析

水解60min后，三组蛋白酶水解液及原乳的SDSPAGE图如图5所示，胰蛋白酶、风味蛋白酶分步水解液中αs-酪蛋白几乎完全被水解掉，而风味蛋白酶和胰蛋白酶水解液中有少量αs-酪蛋白残余，三组蛋白酶水解液中β-乳球蛋白含量均有下降，但仍有一定量残存。三组蛋白酶水解液中α-乳白蛋白含量下降较明显，残留量均较少。经胰蛋白酶、风味蛋白酶分步水解后，产生大量分子量小于14.4ku的肽类，胰蛋白酶和风味蛋白酶水解液中也有一定量低分子量的肽产生。

图5 牛乳与牛乳水解液的SDS-PAGE图Fig.5 SDS-PAGE of full fat milk and its hydrolyzate

2.7 水解液的快速蛋白质液相色谱分析

图6 分子量分布测定的标准曲线Fig.6 Standard curve of molecular weight distribution

图6显示了利用快速蛋白质液相色谱检测出标准蛋白的分子量与洗脱体积的标准曲线。

图7 胰蛋白酶、风味蛋白酶分步水解液的分子量分布图Fig.7 Molecular weight distribution of trypsin and flavourzyme hydrolysis by step

图7为反应60min后胰蛋白酶、风味蛋白酶分步水解液的分离曲线，水解液被分离出7个组分，分别标识为a、b、c、d、e、f、g，这几个组分的分子量分别为145900、6735、4944、3630、2664、1676、1230u，经过胰蛋白酶、风味蛋白酶分步水解后分子量主要集中在5000u以下，只有少量分子量集中在1ku以上，充分说明，αs-酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白大量被水解后转变为小分子量的肽类。

3 结论

通过研究发现，胰蛋白酶、风味蛋白酶单独水解及胰蛋白酶和风味蛋白酶分步水解牛乳，均可使α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、αs-酪蛋白的抗原性降低，且胰蛋白酶和风味蛋白酶分步水解使各蛋白质的抗原降低率更为明显，尤其对于β-乳球蛋白的抗原降低率更大，水解产物苦味更低。双酶分步水解后有大量的分子量低于5000u的肽产生，虽然多数构象抗原表位被水解掉，仍然有线性表位存在，仍然有过敏性，还需继续研究。

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