李鹏飞 梁克伟 辛 阳 张忠良

（中国刑警学院 辽宁 沈阳 110035）

4种纸张汗潜指纹显现方法对STR分型影响的研究

李鹏飞 梁克伟 辛 阳 张忠良

（中国刑警学院 辽宁 沈阳 110035）

研究常用4种纸张汗潜指纹显现方法对DNA提取的影响，特别是纸张上显现后残缺指纹中提取人类DNA的可行性。筛选出一个既能显现指纹又能对提取人类脱落细胞DNA影响最小的技术方法，应用于法庭个体识别和亲权鉴定。

法医物证学 汗潜指纹 PCR扩增 STR分型

人类的指纹终生不变，没有两个完全相同的指纹，是世界上公认的也是最重要的个体特征之一，被广泛应用于刑事侦查和保密工作之中。纸张上很容易获得指纹，但是因为各种条件限制我们常常得到的是不完整的指纹，给我们刑侦工作带来困难。

人类的DNA分析应用于法医物证鉴定是20世纪法庭科学领域最引人注目的成就，是利用分子生物学方法，对案件所涉及的生物检材的DNA进行分型，达到个人识别或亲子鉴定的目的。世界上有120多个国家和地区已应用DNA分析技术办案，解决刑事案件、民事纠纷问题，以及追查尸体身源，包括战争及大型灾难中罹难者的个人识别等，个人同一认定接近100%。

现代研究显示：与人体接触过的物体表面常常附有体表脱落的上皮细胞成分。有试验证明，人体只要接触物体表面5秒钟以上，即有可能细胞遗留在物体上，也就是说指纹当中有可能留下核DNA及线粒体DNA。

有鉴于此实际情况常常让刑事技术人员陷入两难处境，如果显示指纹就提不了人类的DNA，如果先提人类的DNA就破坏了指纹。如果能筛选出在指纹显示后的纸张上特别是残缺指纹中找到提取人类DNA的方法，探索DNA复合扩增的可能性及扩增条件，把两大个体识别技术结合起来，对我们侦查工作无疑带来极大的帮助。

由于指纹中DNA含量少，不同指纹显现方法对DNA提取的影响大小各异，所以目前国内系统的指纹DNA提取技术一直没有建立起来，遇到这类案件时不能进行相应的检验。随着社会的经济发展，纸张与人之间的关系也越来越密切，所以，纸张上指纹显示方法对人类DNA提取影响研究显得越来越迫切，特别是在一些较为重大的的案件，能够为法庭的审判提供确切的证据，对政法机关的刑事或民事案件具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

5%chelex-100、蛋白酶K、IdentifilerTM复合扩增荧光STR试剂盒。

1.2 主要仪器

温箱、离心机、振荡器、GeneAmp system 9700（ABI）。

3130 Genetic Analyzer（ABI公司）。

1.3 主要软件

GeneMapper IDv3.1软件。

1.4 指纹显现试剂

DFO、茚三酮、硝酸银、碘。

1.5 其他材料

牛皮纸张（东莞市文通纸业有限公司）。

1.6 方法

1.6.1 汗潜指纹的制备及显现

20名自愿者每人在牛皮纸指定位置用左手食指指腹按压5枚指纹，其中一枚指纹作为空白对照，这枚指纹的压力和按压时间保证能够作出全部基因位点，其他4枚指纹按照这个压力和时间采集，每枚指纹进行一种显色。这样每种显色方法有20枚指纹。显现方法有DFO、茚三酮、硝酸银、碘熏，具体操作方法见《痕迹检验学试验手册》。

1.6.2 5%chelex-100提取纯化法

将显现的指纹用剪刀从纸张上剪下来，剪碎放在1.5ml的离心管中，每个管中加20μl的5%chelex-100，Pk2μl，56℃温浴 50min，振荡 10s，煮沸15min，振荡10s，13000转离心5min。

1.6.3 STR复合扩增

IdentifilerTM复合荧光STR试剂盒扩增，热循环条件：95℃11min(94℃1min 59℃1min 72℃1min)×28循环60℃60min 4℃保温

1.6.4 扩增产物电泳检测

分型在16道3130型分析仪（ABI USA）上进行，用Gene mapper IDv3.1软件分析结果。

2 结果

4种纸张汗潜指纹显现方法STR成功率统计

3 讨论

3.1 各种纸张汗潜指纹显现方法对STR分型的影响

汗潜指纹之所以能够提取DNA，不是因为角化的上皮细胞，因为这些细胞的细胞核已经消失，而是因为那些未完全角化就已脱落的细胞，以及那些手指接触身体别的部位所脱落的有核细胞，所以其量是非常微弱的，同时纸张表面比较光滑，脱落的细胞不易随着汗液粘附于纸张表面。本研究通过对纸张汗潜指纹显现后，分析STR分型，发现用DFO、茚三酮、硝酸银显现的纸张汗潜指纹分别有50%、56%、63%的STR位点未能显现，效果不是很理想，而碘熏方法则100%有STR位点显现，并且在20例中有15例16个基因位点完全显现。

DFO显现方法的原理：DFO化学名为1，8-二重氮-9芴酮，DFO与α-氨基酸发生反应，在白光照射下，生成淡红色化合物，手印纹印非常弱，在多波段光源蓝绿光（515nm～530nm）的激发下，通过橙色滤光镜观察，手印呈橙红色荧光。该方法只是与汗液中的氨基酸发生反应，虽然不会破坏细胞核中的核酸大分子，但形成的络合物成分与chelex-100混合时，离心不能将其沉淀，影响DNA扩增，STR分型效果不好。

图1 DFO显现后DNA图谱

茚三酮显现的原理：茚三酮与汗液中的物质成分的化学反应很复杂，但是主要是与汗液中的氨基酸发生化学反应生成醛（RCHO）、氨（NH3）、二氧化碳（CO2），同时茚三酮被还原，NH3与还原的茚三酮及过量的茚三酮缩合，生成深紫色的络合物（鲁赫曼紫），从而显出紫色的手印纹线。该方法只是与汗液中的氨基酸发生反应，不会破坏细胞核中的核酸大分子。但是由于形成大分子成分与chelex-100混合时，离心不能将其完全沉淀，其中的化学成分在扩增时可影响DNA的扩增，STR分型效果不好。

图2 茚三酮显现后DNA图谱

硝酸银显现原理：硝酸银显现方法是利用硝酸银与汗液中的氯离子发生化学反应，生成氯化银沉淀，氯化银在强光作用下极易分解为银离子和氯气，从而将手印显现出来，但是随着光照的加强，反应会不断进行，银离子的增多会使物质变黑，因此掌握光照的强度和时间，避免反应过度，影响显现效果。由于重金属离子影响DNA聚合酶活性，不能有效地进行PCR扩增，显现指纹后有些位点峰没有出来。同时光照的强度和时间也不容易控制，在一定程度上也造成了细胞核DNA的损坏。

图3 硝酸银显现后DNA图谱

碘熏显现的原理：手印物质中的油脂和汗垢物质对碘有粘附作用而产生物理性附着；同时手印物质中的不饱和脂肪酸吸收碘而发生化学反应生成二碘硬脂酸，使紫褐色的碘蒸气和手印物质中的皮脂和油脂发生反应变成棕黄色，从而将手印显现出来。由于碘在常温下能升华，产生物理附着的碘若不固定将很快蒸发，并且碘所产生的化学反应具有可逆性，故碘显现的手印很快就会消失，要及时采取一定措施固定和提取。碘熏法显现手印不会损坏客体，碘对细胞的损坏不大，并且chelex-100提取时，碘一部分已经蒸发，所以不会影响扩增和电泳，实验结果峰的显现效果理想。

图4 碘熏显现后DNA图谱

3.2 提高纸张汗潜指纹DNA检出率的方法及建议

由于纸张上指纹中的DNA含量特别微量，再加上纸张表面比较光滑，所以纸张汗潜指纹DNA提取量非常少，而能否提取足量的DNA是成功进行PCR分型的必要条件。为了尽量提高纸张汗潜指纹DNA的检出率，在实际案件中应该注意：①显现方法优化。DFO、茚三酮、硝酸银等试剂显现用量尽量少，足够覆盖指纹为止，这样既可以减少试剂冲刷造成的细胞损耗，也可避免这些试剂中化学成分对DNA提取和扩增的影响；碘熏显现拍照后，一段时间等碘蒸发后再提取DNA，这样可以避免碘对DNA提取和扩增的影响。②转移方法。纸张是渗透性的载体，所以为了避免细胞的进一步损耗，可以采取将纸张指纹部分剪下，转移到离心管中，运用5%chelex-100连带纸张一起提纯，这样可以避免丢弃纸张造成的细胞丢失，同时适当延长温浴时间和煮沸时间，使DNA释放更加完全。③小体系提取。本实验分别采用10ml、20ml体系，图谱质量为 10ml体系 ＞20ml体系。Michelle等对缩小体系进行研究，采用5ml体系，DNA的检验灵敏度能够达到0.03ng。④低拷贝模板PCR技术应用。由于指纹DNA量非常微量，所以扩增时应增加IdentifilerTM复合荧光STR试剂盒规定的DNA模板量，同时增加循环次数，但是增加PCR扩增循环数太多，出现杂带机率增加，本实验通过研究表明，PCR扩增28个循环最有效，因此扩增时，采用模板梯度扩增，综合分析结果，避免错误。⑤增加电泳DNA模板量。由于纸张指纹DNA模板量非常微弱，常规模板量可能达不到理想的峰高，所以可以适当增加电泳模板量。

通过对DFO、茚三酮、硝酸银、碘熏四种纸张汗潜指纹显示方法的比较，我们建议在实践中尽量采用碘熏的方法，以降低对DNA提取的影响。

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注：本文系公安部应用创新项目“指纹显现方法对DNA提取的影响研究”的阶段性研究成果，项目编号：2011YYCXXJXY122。