陈 曦， 曹 慧， 徐 斐， 李红梅， 于劲松

(上海理工大学医疗器械与食品学院，上海 200093)

盐酸克伦特罗(CL)俗称瘦肉精，为一种β兴奋剂、平喘类药物。然而一些不法分子为提高猪肉中瘦肉含量，将其添加在饲料中，而残留在禽畜体内的盐酸克伦特罗代谢消除缓慢，会通过食物链直接危害到人类健康。美国食品和药物管理局(FDA)和世界卫生组织(WHO)制定了畜产品中瘦肉精的最高残留限量，其中，畜肉中的最高残留限量为0.2 μg/kg［1］。目前用于瘦肉精检测的试剂盒大多采用间接竞争ELISA技术，但这种方法步骤繁琐，操作复杂。而直接竞争性ELISA法根据受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合的原理进行检测，可提高检测效率，节省检测成本。

直接竞争ELISA法中所用酶标抗原的标记酶主要有辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酯酶(AP)。碱性磷酸酯酶成本较高，辣根过氧化物酶是ELISA中应用最为广泛的标记酶。辣根过氧化物酶具有较易提取、价格相对低廉、性质稳定及与抗原或抗体偶联后活性损失小等优点。目前，酶标记抗原的制备方法主要有偶氮化法［2-3］、戊二醛法［4］、碳二亚胺(EDC)法［5］等。其中偶氮化的反应过程过于激烈，酶活性损失很大，不能用于酶标抗原的合成。本试验选取辣根过氧化物酶作为抗原标记酶，采用EDC法制备酶标抗原，并对酶标抗原的性质进行鉴定。

1 材料与方法

1.1 试验材料

碳二亚胺(EDC)、琥珀酸亚胺(NHS)，均为上海延长生物有限公司产品;戊二醛、酪氨酸为国药化学试剂有限公司产品;辣根过氧化物酶(HRP)，为上海东风生物科技有限公司产品;Na2HPO4、KH2PO4、NaCl、KCl、Na2CO3、NaHCO3、柠檬酸钠、亚硝酸钠等，均为分析纯，为上海高信化工有限公司产品;试验用水为双蒸去离子水。

1.2 酶标抗原的制备

采用EDC法［6-9］制备酶标抗原，步骤为:① 盐酸克伦特罗的重氮化:称取25 mg盐酸克伦特罗溶于4 ml预冷的1 mol/L盐酸中;逐滴加入0.27 mol/L NaNO2溶液，采用淀粉碘化钾试纸进行检测，待其为深紫色时停止滴加NaNO2溶液;4℃冰浴避光反应45 min。②盐酸克伦特罗的衍生化:称取15 mg酪氨酸溶于0.5 ml 1 mol/L氢氧化钠溶液中，用pH 9.6的碳酸盐缓冲稀释至2 ml;将步骤①中重氮化的盐酸克伦特罗缓慢逐滴加入到酪氨酸溶液中，不断搅拌，同时用1 mol/LNaOH溶液调整pH值使其保持在9.0至9.6之间;将反应液置于4℃冰箱中缓慢搅拌12 h，之后用0.22 μm的微孔滤膜过滤，得到盐酸克伦特罗的重氮化衍生物。③酶标抗原的偶联:取2 ml盐酸克伦特罗重氮化衍生物溶液，依次加入14.3 mg碳二亚胺和2.4 mg琥珀酸亚胺，室温搅拌反应2 h;再加入10 mg辣根过氧化物酶，将混合反应液放入4℃冰箱内缓慢搅拌12 h;4℃透析除去游离的碳二亚胺、琥珀酸亚胺、盐酸克伦特罗及盐酸克伦特罗重氮化衍生物等小分子;封闭游离的活性基团后，采用直接ELISA法对偶联液进行鉴定。

1.3 直接竞争ELISA法鉴定酶标抗原与抗盐酸克伦特罗抗体的亲和力

参照文献［10］的方法，将抗盐酸克伦特罗抗体用pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释后，加入到96微孔板中，每孔100 μl，4 ℃孵育12 h;倒出微孔板内液体，每孔加入 250 μl清洗液清洗5次;于微孔板内加入3%明胶溶液，每孔150 μl，37℃孵育2 h;将所制备的酶标抗原稀释20倍，分别加入到微孔板中，每孔100 μl，37℃孵育1 h，每个稀释度做5个平行;重复上述洗涤步骤后，向微孔板内加入 3，3'，5，5'-四甲基联苯胺 (TMB)底物，每孔100 μl，室温反应20 min。加入1 mol/L硫酸终止反应，并于450 nm下用酶标仪读数。

1.4 酶标抗原制备条件的优化

根据单因素试验结果，确定影响酶标抗原制备的主要因素，并以酶标抗原的酶活性大小为评价指标，设计3因素3水平正交试验，以确定最佳的酶标抗原制备工艺。

1.5 直接竞争ELISA法抑制标准曲线的绘制

按照方法1.3中的方法进行操作。以盐酸克伦特罗浓度的对数值作为横坐标，抑制率作为纵坐标，制作直接竞争ELISA抑制标准曲线。

2 结果与分析

2.1 亚硝酸钠用量对酶标抗原酶活性的影响

在酸性条件下，亚硝酸钠可将盐酸克伦特罗的伯氨基重氮化。由酶标抗原活性随亚硝酸钠用量变化的曲线可以看出，随亚硝酸钠溶液体积的增加，酶标抗原与抗盐酸克伦特罗抗体的亲和力呈上升趋势，并在亚硝酸钠溶液体积为0.8 ml(浓度为0.27 mol/L)时，重氮化反应的效果最好，之后随着亚硝酸钠用量的进一步增加，其亲和力下降。

2.2 盐酸克伦特罗与酪氨酸(Tyr)摩尔比对酶标抗原酶活力的影响

碳二亚胺偶联法通常适用于有羧基的半抗原分子的偶联，对于只含有氨基的半抗原，则需要先与含有羧基的蛋白质载体形成中间产物，再与碳二亚胺偶联。由酶标抗原活力随盐酸克伦特罗与酪氨酸摩尔比变化的曲线可以看出，在盐酸克伦特罗与酪氨酸的摩尔比为1∶3时，盐酸克伦特罗衍生化的效果最好。

2.3 盐酸克伦特罗-酪氨酸与碳二亚胺摩尔比对酶标抗原酶活力的影响

酶标抗原活力随盐酸克伦特罗-酪氨酸与碳二亚胺摩尔比变化的曲线显示，随着盐酸克伦特罗-酪氨酸与碳二亚胺摩尔比的增加，OD值显著增加，即酶标抗原的酶活性显著增加，并在两者比例为1∶4时达最大值。当盐酸克伦特罗-酪氨酸与碳二亚胺的摩尔比超过1∶4时，酶活性没有显著性变化，因此选用两者摩尔比例为1∶4进行偶联。

2.4 反应时间对酶标抗原酶活性的影响

由酶标抗原活力随着反应时间变化的曲线可以看出，随着反应时间的增加，酶活性显著增高，这表明碳二亚胺与盐酸克伦特罗衍生物的偶联效果也越好。当反应时间超过2 h后，酶活性达到最大值，即偶联效果最好。因此选用2 h进行碳二亚胺与盐酸克伦特罗的偶联反应。

2.5 酶标抗原制备条件的优化

根据单因素试验的结果，固定盐酸克伦特罗与酪氨酸的摩尔比为1∶3，辣根过氧化物酶与碳二亚胺的摩尔比为1∶400，选取亚硝酸钠用量、盐酸克伦特罗-酪氨酸与碳二亚胺摩尔比和反应时间进行正交试验设计。制备酶标抗原的较优工艺条件为，亚硝酸钠用量为0.8 ml，盐酸克伦特罗衍生物与碳二亚胺摩尔比为1∶4，反应时间为2.5 h，此条件下制备出的酶标抗原酶活性为1.487 U/mg。盐酸克伦特罗衍生物与碳二亚胺的摩尔比对酶标抗原酶活性的影响在0.05水平上最显著。

2.6 直接竞争ELISA抑制标准曲线

绘制盐酸克伦特罗直接竞争ELISA标准抑制曲线，可以看出在1 ng/ml至10 ng/ml之间，抑制率与浓度呈现较好的线性关系。最低检测限为1 ng/ml。

3 结论

采用碳二亚胺偶联盐酸克伦特罗半抗原与辣根过氧化物酶法制备酶标抗原，通过单因素和正交试验确定了最佳制备工艺条件:亚硝酸钠用量为0.8 ml(浓度为0.27 mol/L)，盐酸克伦特罗与酪氨酸的摩尔比为1∶3，盐酸克伦特罗衍生物与碳二亚胺的摩尔比为1∶4，反应时间为2.5 h，辣根过氧化物酶与碳二亚胺的摩尔比为1∶400，此条件下制备出的酶标抗原酶活性为1.487 U/mg。采用此酶标抗原进行直接竞争ELISA测定，绘制出的竞争性抑制标准曲线线性关系较好，最低检测限为1 ng/ml。

［1］SAUER M J，PICKETT R J H，DIXON S N.Distribution and elimination of clenbuterol in tissues and fluids following prolonged oral administration at a growth promoting dose［J］.J Vet Pharmacol Ther，1995，18:81-86.

［2］RODA A，MANETTA A C，PIAZZA F，et al.A rapid and sensitive 384-microtiter wells format chemiluminescent enzyme immunoassay for clenbuterol［J］.Talanta，2000，52:311-318.

［3］徐淑坤，朱兆海.流动注射分析［M］.北京:北京大学出版社，1991.

［4］杨正涛，张乃生，史利军，等.克伦特罗单克隆抗体的制备及与其初步鉴定［J］.中国农学通报，2008，5(5):73-78.

［5］吕会田，乐加昌，陈存社.克伦特罗小分子半抗原偶联率的测定方法研究［J］.饲料工业，2005，26(3):57-59.

［6］MAO S，MAZ A.Mechanization of the Bradford reaction for the spectrophotometric［J］.Biochem，2006，351:155-157.

［7］赵肃清，孙远明，乐学义，等.农药人工抗原合成的研究进展［J］.农药，2005，8(8):337-340.

［8］徐修远，滑 静，胡建民.氯霉素人工抗原的合成及其结合比的测定［J］.中国畜牧兽医，2005，2(32):24-25.

［9］朱国念，吴 刚，吴慧明.有机磷杀虫剂毒死蜱人工抗原的合成与鉴定［J］.中国农业科学，2003，36(6):657-662.

［10］凌钦婕，向军俭，唐 勇.氯霉素多克隆抗体的制备及特性分析［J］.暨南大学学报:自然科学版，2008，10(5):505-509.