高 鹏，钟 俊，王国成

(1. 天津市药品审评中心，天津 300191， 2.天津天士力集团研究院化学药物研究所，天津 300410)

槐定碱(sophoridine)是从我国西北中药苦豆子(SophoraalopecuroidesL)中分离出的一类苦参生物碱，化学结构与苦参碱相似，都属于四环的喹诺里西啶生物碱[1]。槐定碱具有广泛的药理学作用，如抗肿瘤、抗心律失常、抗炎、抗病毒等[2]。2005年8月槐定碱及其制剂盐酸槐定碱注射液(sophoridine hydrochloride injection)作为我国自主研制的一类抗癌新药，经国家食品药品监督管理局批准上市[3]。临床上，槐定碱对恶性滋养细胞肿瘤有显著疗效，对恶性淋巴瘤和消化道肿瘤也有一定疗效，具有安全性好、毒副反应低等优点。槐定碱结构与现有抗癌化疗药结构都不相同，是新型结构的抗癌新药，对槐定碱进行结构改造并进一步研究其构效关系的报道很少[4,5]，而且不破坏槐定碱骨架对其进行结构修饰的研究未见报道。因此本试验以槐定碱为先导化合物，对槐定碱骨架的14位碳进行结构修饰，合成了8个槐定碱衍生物，并进行体外抗肿瘤活性评价。衍生物①、②和③的合成参考文献方法改进[6]，并进一步对②和③的立体构型进行了鉴定，随后通过控制反应条件来控制产物的立体构型，合成路线见图1。

1 仪器和试剂

Bruke AV400 超导核磁共振仪；Agilent G6300离子肼质谱；SHZ-III型循环水真空泵；DF-101s恒温集热磁力搅拌器；Laborota 4001旋转蒸发仪；Vacuubrand MD4C隔膜真空泵；YRT-3熔点仪，温度未经校正。槐定碱(>98%，江苏南京泽朗医药科技有限公司)；所用试剂均为市售的分析纯或化学纯试剂，薄层层析和柱层析分别采用GF254和200～300目硅胶(青岛海洋化工厂)。

图1 槐定碱衍生物的合成

2 实验方法

2.114-二氯槐定碱(化合物①)的制备 将槐定碱 5 g (0.02 mol)和二氯亚砜 100 ml (1.40 mol) 置于500 ml 圆底烧瓶中，油浴中搅拌加热80 ℃反应12 h，自然冷却至室温，将反应液倒入1 L冰水中，不断搅拌，用6N的氢氧化钠溶液中和至pH=7，用500 ml × 3 CH2Cl2萃取，无水Na2SO4干燥，减压浓缩，经硅胶柱层析分离，乙酸乙酯-石油醚(4∶1)洗脱，可得亮黄色固体4.5 g，收率70%。mp 125 ～ 127 ℃，1H NMR (400 MHz， CDCl3): δ 3.54-3.47 (m, 2H), 3.28-3.21 (dd, 1H), 2.89-2.86 (m, 1H), 2.85-2.75 (m, 2H), 2.66-2.59 (m, 1H), 2.27-2.17 (m, 2H), 2.15-2.08 (m, 1H), 2.01-1.79 (m, 6H), 1.74-1.59 (m, 2H), 1.58-1.45 (m, 3H), 1.13-1.02 (m, 1H)。MS: m/z 339 [M+Na]+。

2.214 α-氯槐定碱(化合物②)和14β-氯槐定碱(化合物③)的制备 将化合物① 5 g (16 mmol) 溶于100 ml 无水乙醇中，加入200 mg 10% 钯碳，在氢气压力为5.0 MPa压力下，加热80 ℃反应24 h，自然冷却至室温，过滤除去钯碳，减压浓缩滤液，经硅胶柱层析分离，乙酸乙酯-石油醚(3∶1)洗脱，可分别得到亮黄色固体(化合物②和化合物③)分别为2.0 g和1.6 g，总收率81%。化合物② mp 133～135 ℃，1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 4.40-4.37 (q, 1 H,J= 5 Hz, 10 Hz, 14-H), 3.41-3.36 (m, 1 H), 2.86-2.83 (m, 1 H), 2.77-2.70 (m, 1 H), 2.35-2.26 (m, 2H), 2.24-2.16 (m, 2 H), 2.04-1.98 (m, 2H), 1.96-1.83 (m, 3H), 1.81-1.75 (m, 1H), 1.72-1.60 (m, 1H), 1.58-1.45 (m, 4H), 1.43-1.37 (m, 1H), 1.10-1.00 (m, 1H)。MS: m/z 305 [M+Na]+；化合物③ mp 85 ～ 88 ℃，1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 4.34 (dt, 1H,J=4 Hz, 14-H), 3.39-3.43 (dd, 1H,J=5 Hz, 14 Hz), 3.32-3.37 (m, 1H,J= 5 Hz), 3.02-3.08 (m, 1H), 2.76-2.79 (m, 1H), 2.65-2.71 (m, 1H), 2.03-2.10 (m, 3H), 1.94-2.01 (m, 2H), 1.81-1.92 (m, 3H), 1.71-1.79 (m, 3H), 1.51-1.62 (m, 2H), 1.38-1.49 (m, 3H), 0.90-1.00 (m, 1H)。MS: m/z 305 [M+Na]+。

2.314 β-乙酰氧基槐定碱(化合物④)14α-乙酰氧基槐定碱(化合物⑤)的制备 将化合物② 5 g (18 mmol)、50 ml 二甲基甲酰胺和醋酸铯 5 g (26 mmol)置于100 ml 圆底烧瓶中，加热120 ℃反应12 h，自然冷却至室温，将反应液倒入200 ml水中，用100 ml × 3 CH2Cl2萃取，无水Na2SO4干燥，减压浓缩滤液，经硅胶柱层析分离，乙酸乙酯-石油醚(5∶1)洗脱，可得到无色油状物 1.4 g，收率64%。同法制备14α-乙酰氧基槐定碱(化合物⑤)。化合物④ mp 84 ～ 86 ℃，MS:1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 5.24-5.21 (m, 1H, 14-H), 3.48-3.42 (m, 1H), 3.37-3.31 (m, 2H), 2.90-2.86 (m, 1H), 2.81-2.75 (m, 1H), 2.29-2.22 (m, 2H), 2.15 (s, 3H), 2.11-2.09 (m, 1H), 2.03 (m, 7H), 1.78-1.64 (m, 2H), 1.59-1.41 (m, 4H), 1.16-1.05 (m, 1H)。m/z 329 [M+Na]+；化合物⑤ mp 141～143℃，1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.58-3.53 (dd,J=6 Hz, 11Hz, 1H, 14-H), 3.47-3.41 (m, 1H), 3.14-3.07 (m, 1H), 2.89-2.86 (m, 1H), 2.81-2.75 (m, 1H), 2.28-2.24 (m, 1H), 2.20-2.13 (m, 5H), 2.11-2.04 (m, 1H), 2.01-1.89 (m, 3H), 1.87-1.80 (m, 2H), 1.77-1.70 (m, 1H), 1.67-1.65 (m, 4H), 1.53-1.47 (m, 3H), 1.09-1.00 (m, 1H)。MS: m/z 329 [M+Na]+。

2.414β-羟基槐定碱(化合物⑥)14α-羟基槐定碱(化合物⑦)的制备 将化合物④ 200 mg (0.7 mmol)溶于5 ml 甲醇中，加入5 mg (0.09 mmol)甲醇钠，于室温反应12 h，减压浓缩，经硅胶柱层析分离，乙酸乙酯-石油醚(8∶1)洗脱，可得到白色固体 130 mg，收率76%。同法制备14 α-羟基槐定碱(化合物⑦)。化合物⑥ mp 101 ～ 103 ℃，1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.99-3.95 (dd, 1H,J= 6 Hz, 11 Hz, 14-H), 3.63-3.57 (dd, 1H,J= 11 Hz, 14 Hz), 3.31-3.22 (m, 2H), 2.91-2.88 (m, 1H), 2.81-2.75 (m, 1H), 2.40-2.31 (m, 2H), 2.22-2.17 (dd, 1H), 2.13-2.07 (m, 1H), 2.01-1.80 (m, 7H), 1.78-1.66 (m, 2H), 1.61-1.50 (m, 3H), 1.45-1.37 (m, 1H), 1.19-1.12 (m, 1H)。MS: m/z 287 [M+Na]+；化合物⑦ mp 114 ～116℃，1H NMR(400 MHz, CDCl3): δ 3.98-3.94 (dd, 1H,J= 5 Hz, 12 Hz, 14-H)，3.60-3.56 (dd, 1H,J= 4 Hz, 14 Hz), 3.46-3.40 (dt, 1H,J= 5 Hz, 10 Hz), 3.09-3.03 (m, 1H), 2.88-2.85 (m, 1H), 2.81-2.75 (m, 1H), 2.29-2.21 (m, 2H), 2.20-2.13 (m, 1H), 2.10-2.03 (m, 1H), 2.02-1.89 (m, 3H), 1.86-1.82 (m, 1H), 1.79-1.60 (m, 4H), 1.58-1.47 (m, 3H), 1.45-1.35 (m, 1H)，1.08-0.98 (m, 1H)。MS: m/z 287 [M+Na]+。

2.514氯-13,14-脱氢槐定碱(化合物⑧)的制备 将化合物① 200 mg (0.6 mmol)、碳酸锂 100 mg (1.4 mmol)和氯化锂 50 mg(1.2 mmol)置于50 ml 圆底烧瓶中，加热120 ℃反应12 h，自然冷却至室温，加入100 ml 水，用50 ml × 3 CH2Cl2萃取，无水Na2SO4干燥，减压浓缩滤液，经硅胶柱层析分离，乙酸乙酯-石油醚(2∶1)洗脱，可得到亮黄色固体 150 mg，收率84%，mp 99 ～ 111 ℃，1H NMR(400 MHz, CDCl3): δ 6.60-6.62 (q, 1H,J= 3 Hz, 13-H), 3.80-3.84 (q, 1H,J= 6 Hz), 3.60-3.67 (m, 1H), 3.17-3.23 (dt, 1H,J= 6 Hz, 18 Hz), 2.88-2.91 (d, 1H), 2.77-2.83 (m, 1H), 2.59-2.66 (dt, 1H,J= 6 Hz, 18 Hz), 2.12-2.28 (m, 3H), 1.95-2.07 (m, 2H), 1.75-1.90 (m, 4H), 1.59-1.74 (m, 2H), 1.46-1.58 (m, 2H), 1.07-1.18 (m, 1H)。MS: m/z 303 [M+Na]+。

2.6体外抗肿瘤活性

2.6.1体外抗肿瘤活性筛选 用MTT法测试衍生物对HepG 2 (人肝癌细胞)、A549(人肺腺癌细胞)、HCT-8(人结肠癌细胞)、BGC 823(人胃癌细胞)、U 251(人神经胶质瘤细胞)、SHG-44(人脑胶质瘤细胞)、MS 751(人宫颈癌细胞)和WM-266-4(人黑色素瘤细胞)的体外抗肿瘤活性。收集生长良好的肿瘤细胞，用含10%小牛血清的DMEM及RPMI 1640培养基分别配制成1.0～1.5×104/ml细胞悬液，于96孔培养板内接种，每孔100 μl，置37 ℃、5% CO2温箱内培养24 h后加药，实验设空白对照，受试样品设3个浓度，每浓度3个平行孔，置37 ℃、5% CO2温箱内培养4 d。弃去培养液，每孔加入MTT溶液(0.4 mg/ml，无血清RPMI 1640配制)100 μl，37 ℃孵育4 h。弃去上清液，每孔加入DMSO 150 μl，溶解Fomazan颗粒，轻度振荡后，用550型酶标仪在检测波长540 nm，参考波长405 nm下测定OD值，并计算肿瘤细胞生长抑制率。结果见表1。

2.6.2不同浓度下化合物对胃癌BGC823的抑制活性 化合物浓度为100、200和400 μg/ml时对胃癌BGC823的抑制率，见表2。

表1 100 μg/ml浓度下化合物的对不同肿瘤的抑制活性

表2 不同浓度下化合物对胃癌细胞BGC823的抑制活性

a: 5-FU 浓度为10 μg/ml

3 结果与讨论

3.1通过柱层析可分别将14α-氯槐定碱和14β-氯槐定碱这一对非对映异构体分开，为了进一步确定这两个异构体的14位具体构型，试验中通过二维核磁结合其立体结构进行了鉴定。通过NOESY谱图可以看出，14α-氯槐定碱14位氢处于a键，该氢和13-Ha、13-He和12-Ha相关(图2)。而14β-氯槐定碱14位氢处于e键，该氢与13-He和13-Ha都有相关，但与12-H无相关(图3)。14-乙酰氧基槐定碱的制备是通过醋酸铯对14位氯的SN2取代完成的，这是一个构型翻转的反应，因此得到的构型正好与相应的14-氯槐定碱构型相反。14-乙酰氧基槐定碱通过甲醇钠催化的醇解可得到14-羟基槐定碱，这是一个构型保持的过程。

图2 14α-氯槐定碱的立体结构及其NOESY谱图

图3 14β-氯槐定碱的立体结构及其NOESY谱图

3.2合成的14位氯取代槐定碱衍生物①、②、③和⑧对胃癌、神经胶质瘤和脑胶质瘤的抑制活性均明显高于槐定碱。二氯取代的化合物①对结肠癌和宫颈癌，以及14位为单氯取代的化合物②、③和⑧对黑色素瘤的抑制活性明显优于槐定碱及其他化合物。相同取代基不同构型也会对活性产生影响，例如：14β-羟基衍生物⑥对肝癌、脑胶质瘤和宫颈癌的抑制活性优于α-羟基衍生物⑦，而对肺癌和胃癌的结果正好相反。14β-氯槐定碱③对宫颈癌具有一定抑制活性，而其α构型基本没有抑制活性。14单氯取代的衍生物②、③和⑧对胃癌的抑制活性随着浓度增加而提高，尤其是14氯-13,14-脱氢槐定碱⑧，抑制率可达98%，明显高于槐定碱。

3.3槐定碱注射液有显著稳定的临床抗癌疗效，但具有一定的神经毒性，同时有报道已证实槐定碱在抗心律失常、保护心肌缺血、抗病毒、镇痛等方面具有显著药理作用。因此，对槐定碱进行结构修饰，减小槐定碱毒副作用，提高其活性，以期更有效和充分的利用槐定碱具有重要意义。

1 洪阁，刘培勋. 槐属植物生物碱化学系成分及药理作用研究进展[J]. 中草药，2005，36(5)：783

2 田真真，万红娇，杨翠萍. 槐定碱的药理研究综述[J]. 中国实验方剂学杂志，2010，16(11)：219

3 李学梅，吴运光，潘达鑫，等. 新型抗肿瘤药槐定碱[J]. 中国新药杂志，2006，15(8)：654

4 赵午莉，李新. 槐定碱衍生物的设计合成及抗肿瘤构效关系研究[A]. 2011医学科学前沿论坛第十二届全国肿瘤药理与化疗学术会议论文集，2011:24

5 李新. 槐定碱类似物的设计合成与抗肿瘤活性研究[D]. 北京协和医学院硕士论文，2011:1-16

6 S Iskandarov, D Dzh,Kamalitdinov, M R Yagudaev,etal. Derivatives and stereochemistry of the matrine alkaloids[J]. Khimiya Prirodnykh Soedineii, 1971, 7(2): 165