吴 霁，柯琴梅，范 恒

(1 南昌大学第三附属医院，南昌 330000;2 华中科技大学同济医学院附属协和医院)

T细胞的凋亡抑制在结肠炎发病机制中起重要作用。T细胞凋亡受抑，体内T细胞将过度活化与增殖，并分泌炎性因子如 IL-4、IL-5、IL-13、TGF-β等，导致肠道炎症发生。脾脏是免疫细胞尤其是T细胞居住的场所，也是细胞免疫应答产生的重要场所，研究表明，脾脏T细胞数目及功能与机体免疫反应呈正相关［1，2］。目前，关于脾脏组织 T细胞的凋亡抑制在结肠炎发病机制中的作用尚不十分清楚。2011年5～11月，我们观察了乌梅丸对2，4，6-三硝基苯璜酸(TNBS)诱导的结肠炎大鼠脾脏组织抗凋亡蛋白Bcl-2 mRNA和蛋白表达的影响，旨在探讨乌梅丸治疗结肠炎的免疫机制。

1 材料与方法

1.1 动物及分组 清洁级健康雄性SD大鼠56只，体质量200～250 g，由华中科技大学同济医学院动物中心提供。将大鼠随机分成空白对照组、结肠炎模型组、美沙拉嗪组、乌梅丸组各14只，饲养于湿度50% ～70%、温度20℃的动物房内。

1.2 方法

1.2.1 模型制作方法 除空白对照组外，其他三组均在禁食不禁饮24 h后，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，导尿管缓缓插入肛门8 cm，注入50%乙醇溶液0.25 mL，继之注入 5% 的 TNBS 溶液 0.3 mL，将大鼠提尾倒置30 s，使药液缓慢进入肠道。大鼠清醒后自由饮食、进水，观察其精神状态、大便颜色和形状、皮毛等变化。

1.2.2 药物干预方法 乌梅丸药液制备:乌梅16 g、细辛 6 g、干姜 10 g、黄连 16 g、当归 4 g、附子6 g、蜀椒 4 g、桂枝 6 g、生晒参 6 g、黄柏 6 g，按传统方法配制成含生药浓度0.515 g/L的水煎剂。美沙拉嗪混悬液制备:取44 g美沙拉嗪用研钵研细，过100目筛，研磨，配成50 kg/L的混悬液。模型建成2 d后，美沙拉嗪组用美沙拉嗪混悬液3 mL/d灌胃，乌梅丸组用乌梅丸药液3 mL/d灌胃，空白对照组和结肠炎模型组用蒸馏水3 mL/d灌胃，连续15 d。排除死亡大鼠，每组最后各剩10只。第16天大鼠禁食不禁水24 h后处死，取脾脏，每个脾脏分为2份，装于EP管中，液氮冰冻保存。

1.2.3 Real time-PCR 方法检测 Bcl-2 mRNA 表达使用RNA提取试剂盒提取脾脏组织的RNA，分光光度计测量 RNA浓度，取5 μL模板 RNA、Oligo(dT)15(10 μmol/L)2 μL、ddH2O(Rnase free)6 μL混匀，放入PCR仪中，70℃ 5 min，立即置于冰上1 min，然后瞬时离心并加入以下试剂:5×RT buffer 4 μL、HRP(RRI)/RNase Inhibitor 0.5 μL、M-MLV 0.5 μL、dNTP(2.5 mmol/L)2 μL，总体积为 20 μL 的反应体系。逆转录条件:42℃ 30 min，99℃ 5 min，4℃ 5 min。引物序列:Bcl-2引物上游:5'-GGTGGTGGAGGAACTCTTCA-3'，下游:5'-ATGCCGGTTCAGGTACTCAG-3'，扩增片段长度157 bp，退火温度58℃;内参 β-actin引物上游:5'-GTCCCTCACCCTCCCAAAAG-3'，下游:5'-GCTGCCTCAACACCTCAACCC-3'，扩增片段长度265 bp，退火温度55.7℃。扩增条件:95℃ 60 s预变性;95℃ 15 s，58℃ 15 s，72℃ 45 s，40个循环。以β-actin为内参，对Bcl-2的产物相对定量，读取CT值，使用2-ΔΔCT方法进行相对定量分析。

1.2.4 Western-blot检测Bcl-2蛋白表达 各组取脾脏组织250～500 mg剪碎，加入裂解液，匀浆抽提总蛋白，用BCA蛋白质定量试剂盒测定蛋白浓度。取70 μg总蛋白上样凝胶电泳，电转移至硝酸纤维膜上，5%脱脂奶粉封闭，依次加入一抗和二抗，室温摇床孵育2 h，TBST充分洗涤，显色曝光，结果用光密度扫描灰度值分析(采用凝胶成像系统分析)。

1.2.5 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件，结果以表示，多组间两两比较用SNK-q检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结肠组织病理改变 结肠炎模型组中固有层和黏膜层内可见弥漫性中性粒细胞、淋巴细胞、浆细胞浸润，结肠黏膜腺体排列紊乱，杯状细胞减少。正常结肠组织黏膜和固有层结构完整，腺体排列较整齐。乌梅丸组和美沙拉嗪组淋巴细胞等炎性细胞浸润较模型组减轻，黏膜及固有层结构相对完整，杯状细胞较模型组多，腺体排列相对整齐。

2.2 各组脾脏组织中Bcl-2 mRNA表达比较 空白对照组、结肠炎模型组、美沙拉嗪组、乌梅丸组的Bcl-2 mRNA 表达相对量分别为1.06 ±0.04、2.48 ±0.43、1.56 ± 0.09、1.57 ± 0.15。与空白对照组相比，结肠炎模型组 Bcl-2 mRNA表达升高(P＜0.05);与结肠炎模型组相比，乌梅丸组、美沙拉嗪组表达下降(P均＜0.05);乌梅丸组和美沙拉嗪组比较无统计学差异(P＞0.05)。

2.3 各组脾脏组织中Bcl-2蛋白表达比较 空白对照组、结肠炎模型组、美沙拉嗪组、乌梅丸组的Bcl-2 蛋白表达量分别为 0.76 ±0.10、1.26 ±0.20、0.96 ±0.16、0.93 ±0.11。与空白对照组相比，结肠炎模型组Bcl-2蛋白表达升高(P＜0.05);与结肠炎模型组相比，乌梅丸组、美沙拉嗪组表达下降(P＜0.05);乌梅丸组和美沙拉嗪组比较无统计学差异(P ＞0.05)。

3 讨论

结肠炎的病因与遗传、感染、环境、免疫等因素相关，是多因素相互作用的结果。正常情况下，机体一方面通过T细胞活化增殖去除抗原，另一方面通过T细胞凋亡抑制T细胞过度产生和活化，从而使肠黏膜内免疫系统处于平衡状态。若T细胞凋亡受抑，体内T细胞将过度活化与增殖，并分泌炎性因子如 IL-4、IL-5、IL-13、TGF-β 等［3］，导致肠道炎症发生。研究提示，溃疡性结肠炎抗凋亡蛋白/促凋亡蛋白比例升高，T细胞凋亡受到抑制［4］，表明T细胞的凋亡抑制在溃疡性结肠炎的发病机制起重要作用。脾脏是细胞免疫应答的重要场所，脾脏T细胞数目及功能与机体免疫反应呈正相关。

乌梅丸出自张仲景《伤寒论·厥阴病篇》，其组方中的乌梅酸敛收固，附子、干姜、桂枝扶阳以胜寒，蜀椒、细辛通阳以破阴。黄连、黄柏苦寒以坚其阴，清以泻热，党参、当归益气养血。诸药合用，使寒热邪去，阴阳协调，气血恢复。全方酸收熄风，辛热助阳，酸苦坚阴，寒热温凉，温清敛补，攻补兼施，诸药配伍，调理阴阳寒热虚实，使之归复于平和。临床研究表明，乌梅丸治疗溃疡性结肠炎有显著疗效［5］。Fan 等［6］研究显示，乌梅丸可下调 NF-κB，减少肠道炎症因子 TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10 释放，减轻肠道炎症损伤。美沙拉嗪属柳氮磺胺吡啶类药物，常用于炎症性肠病的治疗，可抑制前列腺素的合成和炎性介质白三烯形成，显著抑制肠黏膜的炎症反应。

本研究观察了乌梅丸对结肠炎大鼠脾脏组织T细胞抗凋亡蛋白及T细胞凋亡抑制的影响，结果显示，与结肠炎模型组比较，乌梅丸组黏膜及固有层结构相对完整，腺体排列相对整齐，杯状细胞多，炎性细胞浸润减轻;与空白对照组相比，结肠炎模型组Bcl-2的mRNA和蛋白表达升高;与结肠炎模型组相比，乌梅丸组、美沙拉嗪组Bcl-2的mRNA和蛋白表达下降，而乌梅丸组和美沙拉嗪组比较均无统计学差异。提示乌梅丸可能通过下调脾脏组织Bcl-2的mRNA和蛋白表达，增加脾脏组织T细胞的凋亡，减少T细胞分泌炎症因子，从而减轻结肠黏膜的炎症反应，发挥治疗结肠炎的作用。

目前，关于哪些信号转导通路参与下调脾脏组织Bcl-2 mRNA和蛋白表达，使T细胞凋亡受抑尚不清楚。有研究表明，细胞核内的β-arrestin 1可募集组蛋白乙酰化酶p300至Bcl-2基因的启动子，使编码基因Bcl-2的启动子序列区域组蛋白H4乙酰化作用增强，导致 Bcl-2基因转录，促进 Bcl-2表达［7～9］。Bcl-2 表达增加，Bcl-2/Bax 比例升高，抗凋亡信号相对增强，抑制细胞质线粒体释放细胞色素C和caspase活化过程［10］，可抑制T细胞凋亡。乌梅丸是否通过该信号转导通路下调脾脏组织Bcl-2的mRNA和蛋白表达，尚需进一步研究证实。研制以T细胞为靶向的单克隆抗体或其他药物，以降低T细胞的数目和反应性，可望为结肠炎的治疗提供更好的方法。

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