韩新源，陈春燕，寿锡凌，程 功，潘军强，孙超峰(陕西省人民医院心内科，西安 70068;西安交通大学医学院第一附属医院心血管内科;通讯作者，E-mail:csunl@63.com)

心房颤动(房颤)是临床上最常见的心律失常之一，其发病率随着年龄的增长而增加，增龄成为房颤发生的一个重要危险因素［1］。但增龄性房颤的发病机制复杂，目前尚未完全明确。心房电重构是房颤发生和维持的重要因素。研究发现，房颤时L型钙通道的变化在电重构过程中发挥重要作用［2］。随着衰老的过程，L型钙通道在心房表达是否会随着年龄改变而改变，目前尚不清楚。药物治疗是目前房颤治疗最主要的方式，而传统的抗心律失常药物由于其同时具有致心律失常的问题，在房颤治疗中的地位备受争议。鉴于此，房颤的上游治疗即改善房颤基质越来越受到重视［3］。房颤发生和维持基质主要是心房重构，已有大量研究证实肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAS)的激活与房颤心房重构的发生、发展有关，RAS抑制剂可以降低房颤的发生率［4］。因此，本研究通过观察不同年龄段家兔心房组织L-型钙通道表达的增龄性改变，以及卡托普利对老年家兔心房组织L-型钙通道表达的影响，来初步探讨增龄性房颤发生机制及防治策略。

1 材料和方法

1.1 动物分组及给药

健康家兔分为三组:成年组(4-6月龄)、老年组(30-34月龄)、老年干预组(30-34月龄)，每组8只。老年干预组以卡托普利5.5 mg/(kg·d)(商品名:开博通，百时美施贵宝公司生产)用生理盐水稀释后灌胃给药8周;老年组以等容量的生理盐水灌胃8周。实验动物由西安交通大学医学院实验动物中心提供。

1.2 体表心电图检测

家兔麻醉后，记录体表Ⅱ导心电图，采用分析软件测量心率(HR)和P波时限，包括最大P波时限(Pmax)、最小 P波时限(Pmin)，计算 P波离散度(Pd)、P波平均时限(Pa)。

1.3 心房组织AngⅡ的测定

称取100 mg的心房组织，将组织加入适量的生理盐水捣碎。2 000×g离心10 min，取上清液。采用兔(Rabbit)血管紧张素Ⅱ(ANG-Ⅱ)ELISA检测试剂盒(R＆D公司，美国)测定心房组织AngⅡ的含量，实验按照说明书进行。

1.4 逆转录及real-time PCR检测mRNA表达

取100 mg左心耳组织，用Trizol(Invitrogen公司，美国)一步法提取总RNA。应用紫外光分析的方法检测所提取的总RNA的浓度及其OD260mm/OD280mm的比值，所有样本的 OD260mm/OD280mm值在1.8-2.0之间。cDNA合成:取2 μg总RNA参照TaKaRa逆转录试剂盒(大连宝生物公司)进行操作逆转录成cDNA。②引物由北京三博远志生物科技公司合成，序列如下:L-Ca α1C:上游:5’-GACTCCACTTTCACCCCC-3’，下游:5’-TCTCCCCCTTGATTCTTCTGCC-3’;GAPDH:上 游:5’-GCTTTTAACTCTGGCAAAGTG-3’，下游:5’-GATGATGACCCTTTTGGCTC-3’。按照TaKaRa real-time PCR试剂盒操作说明进行反应，采用两步法PCR扩增程序，第一步预变性95℃ 30 s 1个循环，第二步PCR反应95℃ 5 s，59.5℃ 30 s 40个循环。扩增曲线完成后自动生成融解曲线，反应完成后确认扩增曲线和融解曲线。根据Bio-Rad iQ5 Realtime PCR仪软件得出各个样本的Ct值，按照2-ΔΔCt法计算各个基因的相对表达量。

1.5 Western blot检测蛋白表达

提取组织中总蛋白并检测总蛋白含量:取20 μl样品/泳道上样于10%SDS-PAGE进行凝胶电泳;4℃电转膜90 min。TBST封闭1 h，洗脱后加入一抗1∶800(抗 L-Ca α1C，Abcam)及内参 1∶1 000(抗 βactin，Santa Cruz)，4℃过夜。TBST漂洗 10 min×3次后，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶10 000，Santa Cruz)室温孵育1 h后加入 ECL(Pierce)发光底物显色。用Quantity One凝胶图像分析软件对图像进行分析，根据目的蛋白灰度值与内参β-actin灰度值的比值得到各目标蛋白相对含量。

1.6 统计学分析

研究数据以Excel软件建立数据库，采用SPSS 16.0进行统计分析。所有资料用±s描述，对数据进行正态性检验和方差齐性检验后，正态分布资料两组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组兔体表心电图P波平均时限以及P波离散度的比较

成年组P波平均时限为(33.2±5.1)ms，老年组P波平均时限为(46.9±7.6)ms，较成年组延长，差异有统计学意义(P＜0.01)。成年组P波离散度为(8.2±1.8)ms，老年组P波离散度为(15.1±2.7)ms，较成年组P波离散度增大，差异有统计学意义(P＜0.01)。卡托普利干预组与老年组相比，P波平均时限以及P波离散度均缩短分别为(39.7±6.8)ms和(11.8±2.1)ms，差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 各组兔心房组织AngⅡ含量的比较

实验8周后测得成年组心房组织AngⅡ含量明显低于老年组(P＜0.01);卡托普利干预组与老年组相比，心房组织AngⅡ含量明显降低(见图1)。

图1 各组兔心房组织AngⅡ含量比较Figure 1 Comparison of atrial AngⅡlevel among three groups

2.3 各组兔L型钙离子通道α1C亚基基因和蛋白表达的比较

2.3.1 L型钙离子通道α1C亚基基因表达比较老年组L型钙通道α1C亚单位基因表达为1.01±0.35，低于成年组的2.32±0.24(P＜0.01);老年干预组较老年组L型钙通道α1C亚单位基因表达明显上调(1.86±0.49，P ＜0.05，见图2)。

2.3.2 L型钙离子通道α1C亚基蛋白表达比较老年组L型钙通道α1C亚单位蛋白表达明显低于成年组(0.43±0.12 vs 0.96±0.22，P＜0.01);而卡托普利干预后(0.69±0.16)蛋白表达较老年组明显增加(P＜0.05，见图3)。

图2 三组L-Ca α1C mRNA的相对表达量比较Figure 2 Relative expression of L-Ca α1C mRNA in three groups

图3 三组L-Ca α1C蛋白表达量比较Figure 3 The expression levels of L-Ca α1C protein in three groups

3 讨论

本研究结果显示，随着年龄的增加，Pa延长，Pd增大，心房组织AngⅡ的含量增加，L型钙通道α1C亚单位蛋白以及基因表达均呈现增龄性的减少，这些改变可能为增龄性房颤的发生提供基质。服用卡托普利干预后，Pa、Pd缩短，心房组织AngⅡ的含量降低，而L型钙通道α1C亚单位表达均增加。说明卡托普利可以抑制RAS激活，可能在一定程度上逆转心房组织电重构，预防增龄性房颤的发生。

Pa延长标志着心房内传导紊乱，与房颤发生率有很好的相关性。而Pd则是心房非均质电活动的离散程度的反映，Pd增大是房颤发生的预测因子［5］。本研究发现与成年组比较，老年组Pa明显延长，Pd明显增大，这一结果说明Pa和Pd都呈现一种增龄性的变化，提示增龄可以导致心房传导速度延长。心房内传导速度的这种增龄变化考虑可能与增龄过程中心房重构逐渐增加进而导致心房除极时间延长及非均质性电活动的程度加重有关［6］。

近年的研究发现，心房电重构在房颤的发生和维持中起着关键的作用。多种离子参与电重构过程，其中最重要的是 L型钙依赖电流 (ICaL)的变化［7］，它是房颤时动作电位时程(APD)和有效不应期(ERP)改变的主要原因［8］。而离子通道电流变化则是由通道数目的改变所致。L型钙通道由α1、α2、β、δ、γ 五种亚单位组成，其中 α1C 亚单位是 L型电压门控钙通道蛋白的主要亚单位。van der Velden等［9］在山羊模型上观察发现，与窦性心律相比，持续性房颤心房肌的α1C的mRNA表达显著降低。张建成等［10］发现，持续性房颤患者细胞膜L型钙通道α1C亚单位mRNA与蛋白的表达均明显下调。李妙龄等［11］研究表明，在快速起搏心房6 h后心房L型钙通道α1C亚单位mRNA表达下调，其表达含量在随后起搏过程中仍逐渐下降。以上研究结果说明，L型电压依赖型钙通道数量下调可能是房颤心房电重构的分子基础，对房颤的维持和发展有重要作用。本研究结果显示老年组心房组织L型钙通道α1C亚单位的表达下调，这一改变可能是增龄引起心房电重构的原因之一。Anyukhovsky等［12］在研究健康犬心房颤动的易感性增龄性变化的动物实验中发现，老年犬较成年犬动作电位平台期显著缩短、动作电位时程显著延长。既往有研究发现，老年大鼠心室肌细胞的单相动作电位时程MAPD均较青年大鼠明显增大。增加刺激频率后两组MAPD的缩短程度不同，老年组的缩短明显大于青年组。推测其机制可能是ICa-L随着年龄的增长而减小，动作电位相应的代偿性地延长，以维持细胞内外Ca2+的平衡［13］。

已有大量的研究证实肾素-血管紧张素-醛固酮系统的激活在房颤的发生、发展中发挥了重要作用。AngⅡ是RAS的主要活性成分，对多种心肌的离子通道具有作用。研究表明，AT1受体能与Kv4.3结合形成复合物，AngⅡ可以促使该复合物向胞内转运，减少该通道在细胞膜的表达量，使Ito减小［14］。此外，AngⅡ对ICa-L也有调节作用，AngⅡ可以抑制ICa-L亮［15］。本研究显示，老年组 AngⅡ含量较成年组明显增加，而心房组织L型钙通道α1C亚单位的表达较成年组明显减少。此研究结果表明，增龄可以增加心房局部组织AngⅡ含量，可以减少L型钙通道表达，而这些增龄所致的改变可能为增龄性房颤的发生提供基础。RAS阻断剂ACEI和ARB可以通过阻断RAS的激活，减少AngⅡ的产生，从而改善心房的电重构和结构重构，预防房颤的发生。Nakashima等［16］研究了卡托普利和 AT1受体拮抗剂坎地沙坦对心房快速起搏诱发的电重构的影响，结果显示卡托普利及坎地沙坦可有效预防快速起搏导致的AERP缩短。Laszlo等［17］在右房快速起搏前1周应用依那普利，结果发现依那普利可以增加ICa-L亮的电流密度。本研究发现，老年组给予卡托普利干预后心房组织AngⅡ含量下降，Pa缩短，Pd减小，L型钙通道α1C亚单位表达增加。卡托普利可能通过阻滞RAS激活，降低心房肌AngⅡ含量，逆转增龄所致的L型钙通道重构，这一研究结果表明阻断RAS激活可能成为治疗增龄性房颤的一个新靶点。

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