李 鹏，张淑琴，温永俊＊，高维凡

（1.沈阳农业大学，辽宁沈阳110866；2.中国农业科学院特产研究所，吉林长春130122）

牛呼吸道疾病（Bovine respiratory disease，BRD）是危害全球养牛业的主要疾病。然而导致BRD的病因是复杂的，主要是由于传染性病原引起，包括病毒、细菌和支原体［1-2］。此外，应激和环境因素也是重要的诱因，例如断奶、温度、饲养密度、湿度、粉尘、运输，不充足的营养等都是对BRD产生影响的因素［3］。近些年来，随着国内外引种的不断加大，相应疾病的各种病原也在不断增加，BRD变得更为复杂，因此提出了牛呼吸道综合征 （Bovine respiratory disease complex，BRDC）的概念。已分离或检测到的病毒主要有牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）、牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）、牛副流感病毒3型（Bovine parainfluenza virus type 3，BPIV-3）、牛呼吸道合胞体病毒（Bovine respiratory syncytial virus，BRSV）和牛腺病毒2型（Bovine adenovirus B）等。这些主要的呼吸道病毒可以造成牛的免疫系统受到抑制，并且损害牛的呼吸道上皮细胞［4］，从而更加容易引起继发感染，导致BRDC的发生。本文讨论了4种主要的牛病毒性呼吸道病原BVDV、IBRV、BPIV-3、BRSV相应疾病的实验室诊断技术，为防控BRDC提供定期检疫及临床诊断的技术参考。

1 病原学诊断方法

1.1 病毒分离鉴定

BVDV、IBRV、BPIV-3和BRSV可以在牛源的多种细胞上生长，均可以用牛肾细胞培养。现场检查时应采集病牛的鼻腔分泌液或鼻拭子擦拭液，如果剖检则采取气管黏膜、肺部病变部位与正常部位交界处的组织，也可采集血液和脾脏等实质器官。

对于BVDV血液样本是最合适的材料，因为无论是带有母源抗体的小牛，还是急性发病过后带有高滴度的抗体，BVDV病毒都可以在血液中的单核细胞中存活［5］。BVDV可分为致细胞病变型（cytopathic，CP）和非致细胞病变型（non-cytopathic，nCP），CP-BVDV能引起感染细胞变圆，胞浆出现空泡，细胞单层拉网，最后导致细胞死亡而从瓶壁上脱落下来。大多数情况从临床分离到的是nCP-BVDV型，因此，需要对分离毒株的细胞培养物进行免疫荧光或RT-PCR鉴定。IBRV会导致细胞圆缩、聚集成葡萄样群落，在单层细胞上形成空洞，有时会发现巨核合胞体［6］，鉴定致细胞病变的病毒是否为IBRV，细胞培养的上清液必须与特异IBRV抗血清或单克隆抗体进行中和试验。被IBRV感染的细胞，无论在体内还是在体外均能形成嗜酸性核内包涵体。

BPIV-3能引起单层牛肾细胞呈拉网状，最后导致细胞从瓶壁上脱落下来。有一些毒株不会产生明显的细胞病变，可以使用红细胞吸附试验来确认是否有病毒的存在，常用的有牛红细胞和豚鼠红细胞，但有些毒株要在体外适应一段时间后才能出现红细胞吸附现象［7］。BRSV在呼吸系统的细胞培养物上生长最好，尤其牛鼻甲细胞系适于作为分离和培养病毒，病变可见典型的局部细胞融合，气球样细胞，晚期细胞开始表现为肿胀、圆缩、聚集，可见多个典型的合胞体形成，最后出现融合细胞坏死、脱落。病变的细胞用HE染色，镜检可看到嗜酸性核内包涵体。但由于病毒的滴度很低，并且不稳定，运输过程中很易失去生存能力，使其敏感度非常低，所以要求严格的运输过程，尽早接种细胞，才可获得满意的结果［8］。

1.2 病毒核酸检测

核酸检测方法与病毒分离相比有许多优点，这是因为后者不受中和抗体的干扰，敏感性和特异性较高，此外，核酸检测法能够检测有感染性的、不完整的或灭活的病毒粒子的基因组DNA或RNA。

张淑琴等［9］根据GenBank中已公布的BVDV 5′UTR基因序列，设计合成了一对特异性引物，建立了检测BVDV的RT-PCR方法。结果显示该方法从BVDV Oregon C24V中扩增出了特异性片段，而从猪瘟病毒（CSFV）、IBRV、BRSV、BPIV-3中的扩增结果为阴性。陈茹等［10］采用LUX新型荧光PCR技术原理，以IBRV的gC、gE基因为靶基因，建立了快速检测IBRV以及鉴别野毒感染和基因缺失疫苗免疫动物的二重实时荧光定量PCR方法。采用该方法检测全程仅需约2h。Vaucher R D等［11］根据BPIV-3的 HN基因的保守区域设计了一对引物，在所有的检测样品中都能够检测到大小为1 009bp的目的条带，敏感性试验表明，该方法可以检测到95pg的cDNA，而且与人副流感病毒1型、人副流感病毒2型、牛疱疹病毒1型没有交叉反应。Almeida R S等［12］应用套式RT-PCR检测了巴西BRSV，主要针对G基因和F基因，其灵敏度很高，说明套式RT-PCR在诊断和流行病学调查中有较好的应用前景。Boxus M等［13］应用实时荧光定量RT-PCR定量检测BRSV，结果显示该方法比传统的RT-PCR灵敏100倍，同时实现了定量检测BRSV核酸。

2 血清学诊断方法

2.1 病毒中和试验

用病毒中和试验可以检测BVDV的特异性抗体，用200TCID50～500TCID50常量的病毒与用两倍倍比稀释的血清作用1h后，加入指示细胞，置于37℃培养4d～5d后读数，能够阻止50%的接种细胞产生细胞病变的血清的最高稀释倍数即为抗体的效价，一般采用CP-BVDV，因为这样可以直接通过观察病毒的细胞病变来推测有无抑制病毒活性的中和抗体。IBRV、BPIV-3和BRSV都有明显的细胞病变产生，只要有已知标准毒株的免疫血清，通过在敏感细胞上培养后进行中和试验就可以做出鉴定。

中和试验是较敏感、特异的血清学方法，但该方法存在费时费力、试验周期长、易受不确定因素影响等缺点。

2.2 免疫荧光试验

从感染动物的组织中用免疫荧光抗体直接检查病原已经成为一项非常重要的技术。但是，免疫荧光技术在临床上用于BVDV时存在一个问题，从BVDV 持续感染（persistently infected，PI）牛组织样品中检测不到足够的病毒抗原，在很多情况下，在持续感染牛上BVDV检测是阴性［14］。一个可能的解释是BVDV在持续感染动物上没有表达足够的病毒，从而荧光抗体不能够显示足够的阳性信号。这个问题可以通过使用单克隆抗体进行免疫组化试验来减轻影响。据报道，间接免疫荧光试验被用于自然感染牛和试验感染牛鼻咽上皮细胞中BRSV抗原的检测，其中有4%～8%的标本为非特异染色，其原因为试验无客观终点，定量不严格，免疫荧光技术需要高水平的技术人员和高质量的试剂，不适应大批量样本检测。

2.3 酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunesorbent assay，ELISA）是常用的诊断方法之一，既可以检测抗体也可以检测抗原。目前，ELISA方法被广泛应用于牛场牛群的流行病学调查。该方法不仅快速敏感，而且操作简单，对试验条件和人员水平要求不高，在临床上可以得到广泛应用。

BVDV抗原捕获ELISA（antigen-capture ELISA-ACE）使用的目标抗原蛋白主要有两个，一个是 NS3（p80），一个是Erns（E0）［5］。母源抗体存在于小牛的血液样本中，为了避免假阴性的出现，一般推荐小牛在3个月龄后使用该测试方法。在用ELISA检测持续感染牛时，对于小牛来说使用活体组织（如耳朵边缘）可以避免母源抗体的干扰［15］。王冰等［16］通过原核表达系统成功表达了IBRV的gG基因，利用杂交瘤技术表达了抗gG蛋白的单抗，并成功建立了IBRV-gG双抗体夹心ELISA方法，经过检测该方法是有效的，特异性强，有很大的应用前景。周玉龙等［17］构建了BPIV-3的HN基因原核表达载体，成功表达出HN蛋白并初步完成间接ELISA方法的建立，该方法与病毒中和试验符合率高达96%，重复性较好，该方法与牛冠状病毒、IBRV和BRSV阳性血清无交叉反应。Samal S K等［18］使用杆状病毒表达载体在昆虫细胞内表达BRSV N蛋白，以重组N蛋白为抗原建立间接ELISA诊断方法，并对感染牛进行血清流行病学调查，与中和试验相比较，该方法具有较高的敏感性和特异性。Pastey M K等［19］用杆状病毒表达载体表达的F蛋白作包被抗原，建立了检测BRSV血清抗体的间接ELISA方法，与中和试验相比较，该方法快速、敏感、特异。

2.4 胶体金检测技术

胶体金免疫层析技术自诞生以来便以其简便、快速、敏感、特异等优点被广泛应用于兽医临床快速检测和现场诊断上，显示出了巨大的发展潜力和广阔的应用前景。目前，有关胶体金免疫渗滤法和胶体金免疫层析法在牛病检测的研究和应用包括口蹄疫、牛地方流行性白血病、赤羽病、牛轮状病毒病、牛病毒性腹泻、结核病、牛副结核病、布鲁菌病、牛D型产气荚膜梭菌肠毒血症、血吸虫病、牛新孢子虫病等［20］。

Kameyama K等［21］建立了快速检测BVDV抗原的胶体金免疫层析试纸条，该方法与病毒分离鉴定的敏感性和特异性分别为100%和97.2%，为BVDV的快速检测提供了一种有效的方法。王武军等［22］建立了检测IBR抗体的胶体金斑点免疫渗滤法检测试纸，整个试验过程仅需5min即可判断结果，与蓝舌病、牛赤羽病、牛地方流行性白血病、牛病毒性腹泻、猪瘟、猪伪狂犬病和猪细小病毒病的阳性血清不发生交叉反应。将该法与用于IBR抗体检测的ELISA方法同时对300份临床牛血清样品进行IBR抗体检测，结果二者的阳性符合率达94.4%。

3 多重检测技术

目前的BRD不仅仅是单一病原作用的结果，往往是多种病原混合感染造成严重的BRDC。针对混合感染的多重检测技术主要有多重RT-PCR、固相芯片、液相芯片、多重胶体金检测技术等。

Thonur L等［23］针对IBRV的糖蛋白B基因、BRSV核衣壳基因、BPIV-3的核蛋白基因设计的多重反转录定量PCR（mRT-qPCR），通过对临床541份样品检测与传统的病毒分离和间接免疫荧光抗体试验技术比较，证明了该方法更快速，特异性高，并且比病毒分离和间接免疫荧光抗体技术更加敏感。Horwood P F等［24］针对BVDV的5′UTR，IBRV的gc基因，BPIV-3的M蛋白基因设计了多重定量RT-PCR技术，该技术可以同时检测BVDV、IBRV、BPIV-3三种牛呼吸道常见病原，经验证其特异性、敏感性、反应效率与单一引物的定量RT-PCR相一致，没有出现互相干扰的问题。刘晓乐等［25］分别针对BPIV-3特异性NP蛋白保守基因和BVDV保守区段E2基因设计2对引物，经优化反应条件建立了快速鉴别BPIV-3和BVDV的双重RT-PCR诊断方法，对参考病毒株进行梯度稀释检测结果证明该方法检测BPIV-3的敏感度可达10-3TCID50／0.1mL，而 BVDV 的 敏 感 度 达102TCID50／0.1mL。

Puppe W等［26］设计了多重反转录PCR-ELISA技术（mRT-PCR-ELISA），该技术可以同时检测人类9种常见的呼吸道病原流感病毒1型、2型，副流感病毒1型、3型，合包体病毒，肠病毒，腺病毒，肺炎支原体和肺炎衣原体。通过对临床411份样本检测与常规的病毒分离技术、单引物PCR技术相比，该技术是可行的，其敏感度、特异性可以应用于临床检测及流行病学调查。

Anderson S等［27］用美国Luminex公司研制的液相芯片技术设计了多重检测牛血清抗体技术，可以在一个血清样本中同时检测病原BVDV、IBRV、BPIV-3、BRSV相应的抗体，并与ELISA相比较，其敏感度、特异性基本一致，实现了一个液相反应体系下检测多种病原抗体的技术，该技术最高可同时检测多达100种病原，在未来传染病诊断技术中有很好的应用前景。

4 展望

随着分子生物学的迅猛发展，新标记物及新试剂的发明，将会对传染病诊断技术给予新的理论指导。核酸检测技术具有灵敏度高、特异性强、快速、准确等优点，已经成为实验室诊断的主要技术，目前已经发展为既可定性又可定量的分子生物学检测技术，下一步是如何建立准确度高、特异性强的多重核酸检测技术。ELISA技术、胶体金技术以其使用方便，快速，特异性较高，可大批量检测样本等优点逐步成为主要的血清学诊断技术，在未来临床诊断中有很好的应用前景。针对我国目前动物传染病种类多，混合感染严重的问题，开发新一代多重检测技术是今后传染病诊断技术的发展方向。

［1］ Ellis J A.The immunology of the bovine respiratory disease complex［J］.Vet Clin North Am Food Anim Pract，2001，17（3）：535-550.

［2］ Pardon B，De Bleecker K，Dewulf J，et al.Prevalence of respiratory pathogens in diseased，non-vaccinated，routinely medicated veal calves［J］.Vet Rec，2011，169（11）：278.

［3］ Snowder G D，Van Vleck L D，Cundiff L V，et al.Bovine respiratory disease in feedlot cattle：environmental，genetic，and economic factors［J］.J Anim Sci，2006，84（8）：1999-2008.

［4］ Srikumaran S，Kelling C L，Ambagala A.Immune evasion by pathogens of bovine respiratory disease complex［J］.Anim Health Res Rev，2007，8（2）：215-229.

［5］ Walz P H，Grooms D L，Passler T，et al.Control of bovine viral diarrhea virus in ruminants［J］.J Vet Intern Med，2010，24（3）：476-486.

［6］ 徐晓琴，冷 雪，李真光，等.牛传染性鼻气管炎诊断方法研究进展［J］.动物医学进展，2010，31（1）：81-86.

［7］ Barenfanger J，Drake C，Leon N，et al.Clinical and financial benefits of rapid detection of respiratory viruses：an outcomes study［J］.J Clin Microbiol，2000，38（8）：2824-2828.

［8］ 冯军科，薛 飞，朱远茂，等.牛呼吸道合胞体病毒研究进展［J］.中国奶牛，2010（9）：1-4.

［9］ 张淑琴，郭 利，张亭亭，等.牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立及应用［J］.中国畜牧兽医，2011，38（6）：159-162.

［10］ 陈 茹，刘琳琳，曾彩云，等.牛疱疹病毒I型（BHV-1）二重LUX荧光PCR鉴别检测方法的建立［J］.中国兽医科学，2007，37（11）：944-949.

［11］ Vaucher R D，Simonetti A B，Roehe P M.RT-PCR for detection of bovine parainfluenza virus type 3（bPIV-3）［J］.Acta Sci Vet，2008，36（3）：215-220.

［12］ Almeida R S，Spilki F R，Roehe P M，et al.Detection of Brazilian bovine respiratory syncytial virus strain by a reverse transcriptase-nested-polymerase chain reaction in experimentally infected calves［J］.Vet Microbiol，2005，105（2）：131-135.

［13］ Boxus M，Letellier C，Kerkhofs P.Real time RT-PCR for the detection and quantitation of bovine respiratory syncytial virus［J］.J Virol Meth，2005，125（2）：125-130.

［14］ Dubovi E J.Laboratory diagnosis of bovine viral diarrhea virus［J］.Biologicals，2013，41（1）：8-13.

［15］ Munoz-Zanzi C A，Johnson W O，Thurmond M C，et al.Pooled-sample testing as a herd-screening tool for detection of bovine viral diarrhea virus persistently infected cattle［J］.J Vet Diagn Invest，2000，12（3）：195-203.

［16］ 王 冰，郭爱珍，陈焕春，等.针对gG基因的牛传染性鼻气管炎病毒新型检测方法的建立和应用［D］.湖北武汉：华中农业大学，2011.

［17］ 周玉龙，任亚超，朱战波，等.牛副流感病毒3型HN基因原核表达及间接ELISA方法建立［J］.病毒学报，2012，28（1）：23-28.

［18］ Samal S K，Pastey M K，McPhillips T，et al.Reliable confirmation of antibodies to bovine respiratory syncytial virus（BRSV）by enzyme-linked immunosorbent assay using BRSV nucleocapsid protein expressed in insect cells［J］.J Clin Microbiol，1993，31（12）：3147-3152.

［19］ Pastey M K，Samal S K.Baculovirus expression of the fusion protein gene of bovine respiratory syncytial virus and utility of the recombinant protein in a diagnostic enzyme immunoassay［J］.J Clin Microbiol，1998，36（4）：1105-1108.

［20］ 王武军，白泉阳，郑 腾，等.纳米胶体金免疫标记技术在牛病检测中的研究和应用［J］.中国畜牧兽医，2012（8）：87-90.

［21］ Kameyama K，Sakoda Y，Tamai K，et al.Development of an immunochromatographic test kit for rapid detection of bovine viral diarrhea virus antigen［J］.J Virol Meth，2006，138（1-2）：140-146.

［22］ 王武军，徐淑菲，孔繁德，等.牛传染性鼻气管炎抗体的纳米胶体金斑点免疫渗滤法检测［J］.中国兽医科学，2012，42（8）：831-836.

［23］ Thonur L，Maley M，Gilray J，et al.One-step multiplex real time RT-PCR for the detection of bovine respiratory syncytial virus，bovine herpesvirus 1and bovine parainfluenza virus 3［J］.BMC Vet Res，2012，8：37.

［24］ Horwood P F，Mahony T J.Multiplex real-time RT-PCR detection of three viruses associated with the bovine respiratory disease complex［J］.J Virol Meth，2011，171（2）：360-363.

［25］ 刘晓乐，张敏敏，陈颖钰，等.BPIV-3和BVDV双重RT-PCR快速检测方法的建立［J］.动物医学进展，2011，32（11）：1-5.

［26］ Puppe W，Weigl J A，Aron G，et al.Evaluation of a multiplex reverse transcriptase PCR ELISA for the detection of nine respiratory tract pathogens［J］.J Clin Virol，2004，30（2）：165-174.

［27］ Anderson S，Wakeley P，Wibberley G，et al.Development and evaluation of a Luminex multiplex serology assay to detect antibodies to bovine herpes virus 1，parainfluenza 3virus，bovine viral diarrhoea virus，and bovine respiratory syncytial virus，with comparison to existing ELISA detection methods［J］.J Immunol Meth，2011，366（1-2）：79-88.