李书国 袁 涛 王丽然

（河北科技大学食品科学系，石家庄 050018）

油脂在贮存时会自动氧化而酸败变质，进而影响食品的质量安全［1－2］。许多植物油中富含维生素E（生育酚），是天然的抗氧化剂，但高度精炼过的油脂会导致一部分VE损失，使得抗氧化性不足，需要另外添加合成抗氧化剂来延缓油脂氧化，目前油脂中最常用的是叔丁基对苯二酚（TBHQ），结构简式如图1所示。GB 2760—2011中规定THBQ限量为0．2 g／kg。油脂的氧化反应，主要涉及自由基的连锁反应，而抗氧化剂属于酚类物质，可提供质子并干扰或延滞连锁反应中自由基的增殖步骤，并自身形成稳定的共振结构而阻断氧化，提高油脂的稳定性［3－4］。

图1 TBHQ和VE化学结构式

油脂中抗氧化剂的检测方法有高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法法（GC）、薄层色谱法（TLC）、比色法、分光光度法等［5－6］（优缺点如表 1所示），而电化学方法快速、灵敏、简便，测量精度高、选择性好，预处理程序简单，样品分析所需时间短，成本低，便于在线检测。抗氧化剂在体内通过电子转移来清除氧自由基的过程类似于在电极上发生氧化还原反应，可通过电化学方法对其进行检测［7－8］。国内外已有学者将该法用于油脂中抗氧化剂的定量分析研究，并认为该法甚至可替代高效液相色谱法，但是将天然抗氧化剂和合成抗氧化剂共同进行研究的报道很少。Marie Coatanea等［9］采用差分脉冲伏安法用超微电极检测植物油和动物油脂中的VE。Thiago F．Tormin等［10］在含有 50 mmol／L HCLO4的 75%乙醇－水电解质溶液中以玻碳电极为工作电极，多脉冲电流分析法对生物柴油中的TBHQ直接进行安培检测，方法快速、精确，适用于现场检测。Tatiane Alfonso de Araujo等［11］选用滴贡电极以方波伏安法对大豆生物柴油中的TBHQ进行测定，支持电解质为pH7．0的BR缓冲液与甲醇的混合液，并添加表面活性剂Triton X－100以增加信号响应，较HPLC法检测时间短、成本低。

表1 几种抗氧化剂检测方法的特点对比

本试验采用标准加入法，在有机相中以循环伏安法研究了人工合成抗氧化剂TBHQ及天然抗氧化剂VE在玻碳电极上的反应过程与氧化机理，优化电化学法测定两种抗氧化剂的试验条件，考查两种抗氧化剂电分析信号与其浓度之间的关系，验证电分析法测定该2种抗氧化剂在油脂中的抗氧化效果。

1 材料与方法

1．1 试剂与材料

特丁基对苯二酚（THBQ）：国药集团化学试剂有限公司；生育酚：Alfa公司；硫酸、95%乙醇、36%乙酸、无水乙醇、乙醚、抗坏血酸、氢氧化钾：天津市百世化工有限公司；1，4－二氧六环、乙腈、异丙醇、无水氯化锂：天津市博迪化工有限公司；上述试剂均为分析纯；甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；电极预处理所用硫酸溶液用三蒸水配制，其余溶液均用无水乙醇配制；大豆油、玉米油、葵花籽油：市售。

1．2 仪器与设备

LK98BⅡ型微机电化学分析系统：天津兰力科化学电子高技术有限公司；三电极系统（3 mm玻碳圆盘电极为工作电极、铂丝电极为对电极、Ag／AgCl电极为参比电极）、电解杯：上海CHI仪器公司；FA2204型电子分析天平：上海菁海仪器有限公司；KQ2200型超声波清洗仪：昆山市超声仪器有限公司；Dragon MED型微量移液器：大龙医疗设备（上海）有限公司；TGL－10B高速台式离心机：上海安亭科学仪器厂；LC－10A型液相色谱仪（配置RF－10A波长可变的荧光检测器，SIL－10A自动进样器）：日本岛津公司。

固定相：A Nova pak C18（4μm，15 cm ×4．6 mm）大连中国色谱中心；流动相为甲醇与水（98∶2），流速为0．8 mL／min，进样量为 3μL；荧光检测器：激发波长295 nm，发射波长325 nm；色谱图由岛津C－R7A型记录仪记录。

1．3 电化学试验方法

1．3．1 电极的预处理

玻碳电极在测定前依次用 1．0μm、0．3μm、0．05μm Al2O3粉抛光成镜面，用大量蒸馏水冲洗，再分别用丙酮、蒸馏水各超声清洗2分钟，除去表面吸附物。然后置于0．2 mol／L硫酸溶液中用循环伏安法扫描约10 min，扫描速度为50 mV／s，电压范围为－0．5～1．5 V，得到稳定的循环伏安图后，取出，用蒸馏水洗净，室温干燥后备用。每次测定之后，均对电极进行抛光处理后再进行下一次的测定。

1．3．2 标准溶液的配制

用无水乙醇分别配制浓度为1．0×10－2mol／L的VE和TBHQ标准溶液，棕色试剂瓶中避光贮存备用，同时配制1．0 mol／L硫酸的乙醇溶液和 0．2 mol／L氯化锂的乙醇溶液。在10 mL电解杯中加入适量体积的1，4－二氧六环和乙腈，使二者体积比为3∶1；再用微量移液器取适量氯化锂、硫酸、TBHQ及VE注入电解杯中，分别使其浓度达 3．0×10－2、6．0×10－3、2．0×10－4、2．0×10－4mol／L。将三电极插入电解杯中，通氮除氧5 min，用电化学分析仪记录其伏安曲线并优化分析试验条件。

1．3．3 标准曲线的测定

在空白样和加入标准TBHQ、VE溶液样品中，以差分脉冲伏安法分别测量并记录其氧化峰电流响应，平行测定3次，取平均值作为TBHQ、VE氧化峰电流值，考察氧化峰电流值与抗氧化剂浓度之间的关系。所有试验均在室温下于氮气氛围中进行测。

2 结果与讨论

2．1 TBHQ与VE的电化学行为和电极反应过程

在含0．03 mol／L氯化锂、6 mmol／L硫酸、1，4－二氧六环 －乙腈（3∶1，V／V）的支持电解质溶液中，使TBHQ和VE最终浓度为2×10－4mol／L，以玻碳电极为工作电极，Ag／AgCl电极为参比电极，Pt电极为对电极，通过对TBHQ和VE进行循环伏安扫描，记录i－E曲线图（如图2所示），对其电化学性质进行研究。其中，电位扫描范围为1．0～0．2 V，扫描速度为50 mV／s，等待时间为 1 s。

图2 TBHQ和VE在玻碳电极上的循环伏安图

由图2可以看出，TBHQ和VE均只有氧化峰，没有还原峰，说明在此种条件下，二者的电化学性质是不可逆的，氧化峰电位分别为800 mV和640 mV；依据不同电位扫描速度下的循环伏安图，二者氧化峰电流值与扫描速度平方根成线性关系，IpTBHQ＝0．088v1／2－0．169（r＝0．982 0），IpVE＝0．221 7v1／2－0．272 3（r＝0．982 8），且说明这 2种抗氧化剂电化学氧化过程属典型扩散控制过程。扫描过程中，氧化峰电位会随扫速和抗氧化剂浓度的增加向正电位方向偏移（如图3所示扫描速度及抗氧化剂浓度增加对TBHQ氧化峰电位的影响，VE与TBHQ类似，省略）。抗氧化剂氧化峰电位值取决于该化合物氧化还原性质，反映供给电极电子的能力和该物质的电化学活性。电位值越低，越易失去电子而被氧化，抗氧化活性越强。2种抗氧化剂均是向电极提供氢原子而本身形成相对稳定的醌达到抗氧化的效果，如图4所示。VE的出峰位置低于TBHQ，说明抗氧化效果较好，且VE只有一个氧化峰出现，因此该法所得的结果是植物油中VE的总和，不能区分其各个异构体。

图3 扫描速度及抗氧化剂浓度增加对氧化峰电位的影响

图4 TBHQ及VE在玻碳电极上的氧化机理

2．2 试验条件的优化

2．2．1 有机溶剂的选择

TBHQ和VE均为脂溶性抗氧化剂，必须溶于有机溶剂中，选择合适的有机溶剂对电化学方法测定该抗氧化剂非常关键。植物油疏水性较强，若单纯选用甲醇和乙腈等极性较大的溶剂，如乙腈介电常数为38．8，油样很难被溶解，溶液混浊，且有油滴悬浮；而氯仿和1，4－二氧六环均可以增加油样溶解度，使得溶液澄清透明，但二者的介电常数都很小，氯仿为5．1，二氧六环为2．21，介电常数小的溶剂导电性不强，响应电流也不理想，且氯仿低毒。另外所选溶剂必须对植物油样品有足够的溶解度，溶液均一透明，且能溶解所选的支持电解质，以获得良好的导电性，同时溶剂黏度应尽量低，以便保证离子快速向电极迁移。

综上所述，选取1，4－二氧六环与乙腈混合溶液做有机溶剂，且体积比为3∶1时，可以很好地溶解0．5 g植物油样品。并且在0．05 mol／L氯化锂做支持电解质时，浓度为2×10－4mol／L的TBHQ在几种不同溶剂中的循环伏安图（如图5所示）表明在1，4－二氧六环 －乙腈 －氯化锂（3∶1∶6，V／V／V）混合溶剂中所得的TBHQ循环伏安图峰形最好，电流响应最大。

图5 TBHQ在不同溶剂中的循环伏安图

2．2．2 支持电解质的选择

在有机溶剂中，支持电解质必须以离子状态存在，所以一般使用离子倾向性大的阴离子和阳离子，目的是为了增强溶液的导电性，降低有机溶剂的电阻，减小或消除电迁移电流。支持电解质需要满足以下条件：（1）在所研究的溶剂中有足够的溶解度；（2）不发生氧化还原反应，且有较宽的电位窗口；（3）本身不发生电极反应，不会对电极反应产生干扰；（4）价格低廉，容易购得；（5）毒性和危险性较小。

在本试验中比较高氯酸锂和氯化锂对抗氧化剂的伏安电流响应，选用响应信号高的氯化锂作为支持电解质。配制一系列浓度的氯化锂乙醇溶液，在选定的有机溶剂中，以VE为例分别于上述浓度下对其进行循环伏安法测定，如图6所示，结果显示较大浓度的氯化锂响应电流会相对减小，并且峰电位会略微正移。而0．03 mol／L的氯化锂会得到更大的电流响应，并且峰形良好，因此选用0．03 mol／L乙醇氯化锂做支持电解质。

图6 支持电解质浓度对VE的氧化峰电流的影响

2．2．3 硫酸浓度的选择

H＋在抗氧化剂的氧化中起到一定的作用，因此硫酸的乙醇溶液用来调整有机相的pH值，但由于有机溶剂中的pH不能用常规值表示，所以用硫酸溶液的浓度来表示，并利用循环伏安法研究其对抗氧化剂TBHQ和VE电化学行为的影响，如图7所示。以2×10－4mol／L VE为例，由图7可知氧化峰峰电流在硫酸浓度为6 mmol／L时达到最大值，然后基本保持不变。因此本研究选择浓度6 mmol／L的硫酸乙醇溶液用于进一步的研究。

图7 不同硫酸浓度对VE的氧化峰电流的影响

2．2．4 电参数的选择

微分脉冲伏安法能有效降低背景电流，具有较高精确度和灵敏度，因此选择微分脉冲技术对TBHQ和VE进行检测分析。TBHQ和VE的微分脉冲伏安图如图8所示，试验条件为前述所定试验条件。电位范围为1．0～0．2 V、脉冲幅度为80 mV、电位增量为1 mV、脉冲宽度为0．3 s、脉冲间隔为0．05 s时，二者氧化峰电流响应最好，峰形尖锐，可有效降低二者之间的氧化峰重叠程度，扩大电位差。

综上所述，最终确定的最佳电化学分析参数如下：1，4－二氧六环 －乙腈（3∶1；V／V）为最宜有机溶剂；0．03 mol／L乙醇氯化锂为最宜支持电解质，乙醇硫酸浓度为6 mmol／L，脉冲幅度为80 mV，脉冲宽度为0．3 s，脉冲间隔0．05 s。在该参数下，2种抗氧化剂的峰形良好，电位差较大，可获得较高的灵敏度。但是尽管二者峰形良好，仍有些许重叠，因此采用化学计量学方法处理，减少或消除分析物间的相互干扰，提高分析测量的精确度与选择性。

图8 TBHQ和VE的微分脉冲伏安图

2．3 THBQ和VE的线性回归方程

采用标准加入法，分别制备TBHQ和VE不同浓度标准样品。在优化试验条件下，分别记录TBHQ和VE在裸玻碳电极上的差分脉冲伏安图，得到其氧化峰电流值（Ip）与其对应浓度（c）的线性校正模型，如表2所示，同时表2列出灵敏度、检测限、相关系数及线性范围等。

表2 抗氧化剂氧化峰电流值与浓度关系

2．4 电化学法结合化学计量学预测混合样品中的抗氧化剂

偏最小二乘法（partial least squares regression，PLS）是一种基于因子分析的多变量校正方法。该方法同时对测量数据矩阵和浓度组成矩阵进行主成分分解，以它们的主因子进行回归，可改善多组分同时测定的准确度和可靠性［12］。本试验将电化学方法与偏最小二乘法相结合，预测模拟混合样品中的抗氧化剂浓度，分离重叠波谱。

在本研究中，校正组采用正交设计L9（34），配制9组不同浓度的抗氧化剂混合溶液，以差分脉冲法依次记录每个混合溶液的氧化峰电流值（测量3次取平均值），所得测定数据根据偏最小二乘法建立校正模型，见表3。数学模型建立目的是为了未知样本的预测，选取5组混合溶液作为预测组，预测结果如表4。

表3 TBHQ和VE校正组浓度组成

表4 PLS法对预测组浓度的预报结果

2．5 实际样品测定

采用差分脉冲伏安法（DPV）与PLS方法相结合测定3种市购植物油样品（大豆油、葵花籽油及玉米油）中所含的抗氧化剂（所测结果见表5）。目前在油脂中较常用的合成抗氧化剂是THBQ，在葵花籽油与玉米油中均未检出TBHQ，只检出天然抗氧化剂VE，说明这2种植物油所含的生育酚含量较高，使得油脂较稳定，不需额外添加合成抗氧化剂便可达到抗氧化的目的，且可从表5中看出玉米油中所含的生育酚含量要高于葵花籽油。而大豆油中只检测到了TBHQ，没有检测出VE，说明大豆油中不含VE或所含的生育酚的量极少。在检测中，DPV法与PLS法结合测定植物油样品回收率在97．7%～104．2%范围内，并且为了验证该方法的可行性，用HLPC方法（VE按照 NY／T 1598—2008进行测定，TBHQ按照GB／T 21512—2008进行测定）分析同一样品，结果与DPV法基本一致（结果见表6）。因此这种方法是可行的，且可省去各种繁琐的预处理步骤，使得操作简便，精确，具有极高的应用价值。

表5 DPV法与PLS法联用对实际油样中标准加入回收的预测结果

表6 DPV法与HLPC法对相同质量油样中抗氧化剂含量的测定结果

3 结论

3．1 合成抗氧化剂TBHQ与天然抗氧化剂VE均在裸玻碳电极上表现出不可逆的性质，且属于典型扩散控制过程。二者的循环伏安图表明TBHQ的氧化峰电位高于VE，而氧化峰电位表明给予电极电子的能力，电位越低，表明越易失去电子，即越易在电极上发生氧化反应，抗氧化活性越强。因此天然抗氧化剂VE的抗氧化活性强于合成抗氧化剂TBHQ。

3．2 确定电化学法测定两种抗氧化剂的最佳试验条件：1，4－二氧六环 －乙腈（3∶1，V／V）作为有机溶剂溶解支持电解质及植物油样品，0．03 mol／L氯化锂溶液为支持电解质，6 mmol／L硫酸溶液调节电解质溶液的pH值，利用差分脉冲伏安法确定2种抗氧化剂的氧化峰电流与浓度之间的线性回归方程、线性检测范围及最低检测限等。

3．3 在有机相中采用电化学分析法测定实际油样中的抗氧化剂，不需对油样进行提取、分离、纯化等复杂的前处理，且与PLS法相结合对样品进行测定，可有效消除两种抗氧化剂间的相互影响。该法分析所得抗氧化剂VE与TBHQ的含量与HPLC法所测定的VE与THBQ含量一致性良好，表明电化学分析法测定植物油中的合成抗氧化剂TBHQ与天然抗氧化剂VE是可行的，并且操作简便，样品无需预处理，测定结果精确。

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