赵 梅 韩忠杰 孙庆杰

（青岛农业大学食品科学与工程学院，青岛 266109）

玉米胚芽是玉米淀粉加工的副产品，在国内来源比较丰富，含有较高的脂肪及蛋白质，目前一般用于生产玉米胚芽油［1］。玉米胚芽粕是玉米胚芽提取玉米油后的残渣，是玉米油厂的主要副产品，是一种玉米纤维和蛋白质为主的高营养物质［2］，其中粗蛋白质量分数一般为23%～25%［3］，含有人体必需的8种氨基酸，其生物效价PER值与WHO／FAO推荐值相近，并且具有吸油、持水、乳化等功能性质［4］，能被广泛地应用于肉制品、糕点及饮料等食品工业中。但一系列试验表明，玉米胚芽蛋白很难兼顾几种功能特性，或是很难达到某几种特定功能性质的平衡。因此，为了使玉米胚芽蛋白得到更好的应用，必须改善其功能性质［5］。

蛋白质改性就是人为地对蛋白质结构进行修饰从而改善产品在制造、加工和保藏过程中的物理化学性质。目前对蛋白质进行改性主要有化学改性、物理改性、生物酶改性、基因工程改性和复合改性等［6］。酶法改性蛋白质不会导致营养素的损失，也不会产生毒理学方面的问题。而且蛋白质的酶法改性还具有反应时间短，专一性强，酶解程度可控制，在温和条件下即可产生显著效果等优点［7］。张春红等［8］发现谷氨酰胺转胺酶可以改善大豆浓缩蛋白的持水性和吸油性。黄卫宁等［9］认为添加TG改变了燕麦面团的热力学性质。班进福等［10］研究发现MTG对饺子粉品质有明显的改善作用，Sun等［11］研究了TG酶对肌纤维和豆分离蛋白共混物的凝胶性质的影响。但是孙焕等［12］研究TG酶改性大豆分离蛋白改性后发现尽管大豆分离蛋白凝胶性质增加了，但是溶解度降低了，起泡性和泡沫稳定性没有出现太大影响，持水力也只达到了3．47。贺江航等［13］用TG酶改性鱼肉蛋白凝胶硬度只能从4 N提高到14 N。尽管这些蛋白经过TG酶改性某个性质改善了，但是很难兼顾几种功能特性的提高。本试验着重研究了转谷氨酰胺酶（MTG）改性玉米胚芽蛋白粉的最佳条件，如加酶量、改性时间等对玉米胚芽分离蛋白的凝胶性质的影响。此外，还探讨了改性前后玉米胚芽蛋白粉其他功能性质的改善，为进一步研究玉米胚芽蛋白产品提供了一定的参考。

1 材料与方法

1．1 材料与试剂

玉米胚芽：临沂鲁洲集团；微生物谷氨酰胺转氨酶（MTG，酶活力 100 U／g）：德国 AB酶制剂公司；6号溶剂、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、盐酸等均为分析纯。

1．2 主要仪器

TA．XT Plus物性测试仪：英国Stable Micro Systems公司；BS224S型电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；752型紫外可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；PHS－3C精密pH计：上海雷磁仪器厂；FW100高速万能粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；LXJ－ⅡB离心机：上海安亭仪器厂；C－18F电磁炉：广东银港科技股份有限公司；电热恒温水浴锅：龙口市先科仪器公司；BCD－257SL型冰箱：中国海尔集团；DHG－9070A型电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司。

1．3 方法

1．3．1 玉米胚芽蛋白粉的制取

取破碎玉米胚芽，按料液比1∶3加入6号溶剂，在40℃水浴下连续浸提6 h后进行抽滤脱脂，反复浸提、抽滤6次以上。将所得固体放于40℃烘箱进行烘干。将烘干后的样品用高速万能粉碎机粉碎，过100目筛，即可得到试验所用玉米胚芽粉。

α－淀粉酶酶解：准确称取一定量的玉米胚芽粉放于烧杯中，按液料比10∶1加入pH 5．2的磷酸盐缓冲液，沸水浴30 min，之后冷却至37℃。按照酶添加量3 000 U／g加入α－淀粉酶，37℃下反应3 h，离心干燥备用。

酸法提取：准确称取一定量酶解后的胚芽粉，按料液比1∶9加蒸馏水搅拌均匀，滴加1 mol／L的盐酸溶液调节至 pH 4．6。在37℃、搅拌速度为3 000 r／min下反应60 min，取出后离心取沉淀。重复上述步骤调节pH4．6进行酸沉，共重复3次。离心后的固体加入蒸馏水离心洗涤2次，经冷冻干燥即可得到玉米胚芽蛋白粉，蛋白质质量分数大约为40%。

1．3．2 改性玉米胚芽蛋白粉的制备方法

MTG改性玉米胚芽蛋白粉的流程：玉米胚芽蛋白粉加MTG→加pH 8的磷酸缓冲液→水浴（45℃）→离心（3 000 r／min，15 min）→40℃鼓风干燥→粉碎备用

1．3．3 MTG改性玉米胚芽蛋白粉的单因素试验

底物质量分数：在改性时间2 h，加酶量10 U／g的条件下，研究底物质量分数为 4%、8%、12%、16%、20%对玉米胚芽蛋白粉硬度的影响。

改性时间：在控制底物质量分数为12%，加酶量为10 U／g的条件下，研究改性时间为 1、2、3、4、5 h对玉米胚芽蛋白粉硬度的影响。

加酶量：在控制底物质量分数为12%，改性时间为2 h的条件下，研究加酶量为 0、10、20、30、40 U／g对玉米胚芽蛋白粉硬度的影响。

1．3．4 响应面优化试验

在单因素试验的基础上，以底物质量分数、改性时间、加酶量为试验因素，酶改性玉米胚芽蛋白粉硬度为响应值，进行响应面优化试验。采用Design Expert7．1统计软件，进行Box－Behnken设计及响应面分析试验。试验因素水平表见表1。

表1 响应面影响因素及水平

1．3．5 MTG改性玉米胚芽蛋白凝胶硬度测定

参照文献［14］用质构仪进行测定。

1．3．6 MTG改性玉米胚芽蛋白功能性质的测定

持水力测定：称取0．5 g改性后玉米胚芽蛋白粉，溶于9．5 mL蒸馏水中，用玻璃棒搅拌均匀，置于室温下30 min，分散液以3 000 r／min离心10 min，称量下沉物质量m（g），持水力（Water Binding Capability）用下式计算：

WBC＝m／0．5

溶解性测定：将0．25 g玉米胚芽蛋白粉溶于10 mL蒸馏水中，搅拌1 h，分散液以3 000 r／min离心10 min，用凯氏定氮法测定上清液中的蛋白质含量，蛋白质的溶解度定义为上清液中的蛋白质含量占该溶液中蛋白质总量的百分数。

吸油性测定：准确称取改性后样品0．5 g置于10 mL离心管中，加入5 g玉米胚芽油，用玻璃棒搅拌均匀，放置30 min，用3 000 r／min的速度离心30 min，称量下沉蛋白的质量m。吸油性（Fat Binding Capacity）的计算公式为：

FBC＝m／0．5×100%

乳化性及乳化稳定性：测定参照Pearce等［15］的方法，用pH 8的磷酸缓冲液配制质量分数为0．6%的蛋白质悬浮液，取24 mL蛋白质溶液加入8 mL大豆色拉油，用剪切乳化仪在10 000 r／min下高速均质l min制成乳状液，立即用移液管从底部取1 mL乳状液，稀释于 9 mL 0．1%SDS溶液中，以 0．1%SDS溶液作对照，立即用分光光度计在500 nm处测定吸光值（A0）；放置20 min后，再次取样测定。乳化活力（EA）以刚开始的吸光值A0表示，乳化稳定指数（ESI）用下式计算：

ESI＝A0×Δt／ΔA

式中：A0为初始乳化液的吸光值；Δt为20 min：ΔA为20 min后的吸光度与A0之差。

起泡性及起泡稳定性：配制质量分数为1%的改性玉米胚芽蛋白溶液，取出100 mL在高速组织捣碎机中搅打（10 000 r／min）2 min，迅速倒入 200 mL量筒中，记录泡沫体积V1，静置10 min后再次测量泡沫体积V2，起泡性和起泡稳定性计算公式如下：

起泡性 ＝V1／100×100%

泡沫稳定性＝V2／V1×100%

1．4 数据处理

采用Design Expert7．1统计软件及Excell程序对试验结果进行分析。

2 结果与分析

2．1 单因素对酶改性玉米胚芽蛋白粉凝胶硬度的影响

2．1．1 加酶量的影响

由图1可以看出，随着加酶量的增加，凝胶硬度随之增大，当加酶量达到20 U／g后，随着酶添加量的增加凝胶硬度降低。这是因为当底物浓度一定时，加酶量会存在一个临界值［16］。酶添加量过少，酶不足以结合所有的底物，网状结构形成不完全，所以凝胶硬度较低。但加酶量过高会破坏体系中的动态平衡，对底物－酶作用体系产生影响［17］，导致出现加酶量增多，但凝胶硬度降低的结果。

图1 加酶量对玉米胚芽蛋白粉凝胶硬度的影响

2．1．2 底物质量分数的影响

由图2可以看出，随着底物质量分数的增加，凝胶硬度呈现先增大后减小的趋势，底物质量分数为12%时凝胶效果最佳，当底物质量分数为4%时不成胶。这是由于当底物质量分数太小时，在一定时间内蛋白质底物接触几率降低，凝胶形成不完全。蛋白质凝胶的形成机制一般认为是蛋白质－蛋白质和蛋白质－溶剂的相互作用以及邻近肽链之间的吸引力和排斥力平衡的结果，当蛋白质浓度较低时，蛋白质－溶剂相互作用占优势，体系不易凝结成凝胶。当底物质量分数达到一定程度后，体系有效水浓度降低，使得底物蛋白分子和酶分子的碰撞几率降低，从而反应速度降低，使得凝胶形成效率大大降低，凝胶硬度随之降低。

图2 底物浓度对玉米胚芽蛋白粉凝胶硬度的影响

2．1．3 改性时间的影响

由图3可以看出玉米胚芽蛋白凝胶硬度随着改性时间的增加先增加再降低，当改性时间为3 h时，凝胶硬度达到最大值。这是由于随着酶作用时间的延长，酶与蛋白质底物不断反应，形成的交联产物不断增多，从而提高凝胶硬度。但是改性时间继续增加，凝胶硬度呈下降趋势，可能是由于过长时间的热处理导致蛋白质凝胶网络中疏水基团变化、H键以及非共价键的断裂有关［18］。

图3 改性时间对玉米胚芽蛋白粉凝胶硬度的影响

2．2 响应面分析结果

2．2．1 响应面法的试验结果及方差分析

响应面试验设计及结果见表2。

利用Design Expert7．1对表2中的试验数据进行回归拟合，得到硬度Y与自变量改性时间（X1）、底物浓度（X2）、加酶量（X3）的二次回归编码方程模型为：

Y＝95．25＋5．32X1＋1．61X2＋11．84X3－12．95X1X2＋3．99X1X3－0．011X2X3－20．36X12－14．54X22－15．12X32

由于二次回归编码方程模型的各个因素在响应面设计中均经过无量纲性编码处理，且各因素间一次项、交互项与平方项的回归系数均不相关，故可以根据编码方程中各个回归系数的绝对值大小直接比较各因素对响应值的影响程度，依次为：加酶量（X3）＞改性时间（X1）＞底物浓度（X2）。

通过方差分析来验证模型及各参数的显著性见表3。

表3 回归分析结果

由表3可知失拟项P值为0．053 4，大于0．05表明失拟项不显著，模型P值为0．025，小于0．05表明模型显著。同时模型中的参数X3，X12，X22，X32都是显著的。模型相关系数R2＝0．87，表明模型拟合度较好，能较好地反映各因素与相应值变化的关系。

由图4～图6可直观地了解各因素交互作用对响应值的影响。

图4 底物质量分数和酶改性时间对硬度的影响

图5 加酶量和酶改性时间对硬度的影响

图6 加酶量和底物质量分数对硬度的影响

2．2．2 最优条件的求证及验证

通过软件Design Expert得到优化的酶改性玉米胚芽蛋白粉的工艺条件为改性时间3．18 h；底物质量分数 10．88%；加酶量 24．16 U／g，预测最佳凝胶硬度的理论值为98．165 g。对优化条件进行验证试验，重复3次，凝胶的硬度可达到98．13 g，预测值与理论值基本一致。说明响应面优化得到的最佳工艺条件可靠。

2．3 改性前后玉米胚芽蛋白功能性质对比

玉米胚芽蛋白粉提取工艺采用的是酶解结合酸解，与杨丽等［19］采用纤维素酶提取玉米胚芽蛋白质工艺流程相近，但是本试验采用了不同的水解酶－淀粉酶，最后得到的玉米胚芽蛋白粉蛋白质质量分数与其纤维素酶法提取的蛋白质质量分数42．5%接近。本试验做了大量重复试验和放大试验结果蛋白质含量变化不大，所以可以作为试验材料。

在最佳改性条下，即加酶量 24．16 U／g；反应时间190 min；底物质量分数11%，得到的改性玉米胚芽蛋白粉与未改性玉米胚芽蛋白粉的功能性质见表4。

表4 改性对玉米胚芽蛋白粉功能性质的影响

由表4可知经改性处理后持水力增加了35．39%，这是由于以肽链中谷氨酰胺残基的γ一羧酰胺基作为酰基供体，蛋白质或肽键上赖氨酸残基的ε－氨基、游离氨基酸的ε－氨基作为酰基受体，它们在一定条件下形成蛋白质分子内和分子间的ε－（γ－谷氨酰）赖氨酸异肽键［20］，使蛋白质分子发生交联，形成分子内及分子间的网状结构，从而截留住更多的水分。

改性后的玉米胚芽蛋白粉溶解性提高幅度不大，改善效果不明显，约为5%。然而Babiker等［21］用TG对大豆分离蛋白改性试验结果表明，经TG改性后的蛋白质溶解性得到明显改善。这可能是由于MTG改性所导致的溶解性变化是有两方面共同作用的结果：一方面是蛋白质分子交联使分子量增大，从而溶解度下降；另一方面是TG的脱氨作用，使谷氨酰胺和天冬酰胺转化为谷氨酸和天冬氨酸，离子化基团增多，溶解性增加［22］。

改性后吸油性较未变性蛋白提高了56．94%。这一方面是由于网状结构能够吸附更多的油，另一方面是由于网状结构具有阻止油脂迁移的能力。

改性后玉米胚芽蛋白粉乳化能力没有明显改善，而乳化稳定性提高了13．31%。主要是由于MTG酶的作用，在蛋白质分子间和分子内引入了大量的氢键，使蛋白质形成了网状结构，蛋白质－蛋白质或蛋白质－水的作用增加，体系的黏度增加，使乳化体系更加稳定。也有可能是改性蛋白结构内的部分疏水性残基暴露在外，界面张力变小，因此乳状液体系变的更加稳定。乳化能力与蛋白质的溶解性呈正相关，当溶解度提高，它在水－油界面扩散速度和吸附的能力大大提高，使得蛋白质疏水性残基快速向油相排列，形成相应的界面性质［8］。而MTG酶的作用没有改善溶解度，所以乳化能力的提高也很有限。

MTG酶改性后的玉米胚芽蛋白粉起泡能力没有明显改善，而泡沫稳定性提高10．8%。蛋白质的发泡能力与泡沫的稳定性一般是相反地，起泡能力是由蛋白质分子的快速扩散、疏水基团的暴露等因素决定，泡沫稳定性取决于溶液的流变学性质，主要有蛋白质的水合、分子间相互作用。由于改性后的蛋白质间或内相互作用增加，溶液黏度提高，使得形成的气泡稳定性提高。

3 结论

3．1 在单因素试验的基础上，运用响应面分析法优化了玉米胚芽蛋白粉酶改性处理的条件。得到酶改性的最佳工艺条件为改性时间3．18 h；底物质量分数10．88%；加酶量24．16 U／g，在此工艺条件下得到的凝胶硬度为98．13 g。

3．2 MTG酶改性处理对于玉米胚芽蛋白粉持水力、吸油性、乳化稳定性、泡沫稳定性明显提高，而对溶解度、乳化性和起泡性改善的不明显。

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