邢慧芳，李焕敏，王英杰，张旭慧，焦丽琴，李素婷

(1.承德医学院临床医学专业2010级，河北承德 067000;2.指导教师)

学生园地

乙醛刺激大鼠肝星状细胞株HSC-T6增殖的体外研究

邢慧芳1，李焕敏1，王英杰1，张旭慧1，焦丽琴1，李素婷2

(1.承德医学院临床医学专业2010级，河北承德 067000;2.指导教师)

乙醛;肝星状细胞;增殖;模型

肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)的活化增殖与酒精性肝纤维化的形成密切相关，是酒精性肝损伤发展至肝纤维化的中心环节[1]。乙醇的代谢产物乙醛是刺激HSC活化增殖，导致酒精性肝纤维化发生的关键因子[2]。本研究以乙醛作为刺激物，观察乙醛刺激大鼠肝星状细胞增殖的最佳浓度和最佳时间，为后期酒精性肝纤维化的的相关研究提供实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 肝星状细胞株HSC-T6，凯基生物有限公司;DMEM高糖培养基，GIBCO公司;胎牛血清，Hyclone公司;MTT，Sigma公司;DMSO，上海生工。CO2培养箱，日本Taibai LNA-122D;倒置显微镜，德国Olympus;酶标仪，日本BIO-RAD;离心机，上海TGL.16G。

1.2 方法

1.2.1 大鼠肝星状细胞培养:大鼠肝星状细胞株HSC-T6，以含10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃、5%CO2混合气体的CO2培养箱中培养，细胞换液时间为1-2d，传代时间为2-3d，传代前用0.25%的胰酶消化。

1.2.2 细胞分组:细胞传代稳定后，HSC随机分为空白对照组和乙醛不同浓度刺激组，每组设3个复孔。乙醛刺激组给予乙醛刺激，空白对照组常规培养。

1.2.3 MTT法检测不同浓度乙醛对HSC增殖的影响:调整细胞计数为1×105后，均匀接种于96孔培养板中培养，每孔总体积为200μl，各组细胞培养至70%-80%融合时，0.4%胎牛血清DMEM培养基同步化处理细胞12h后，更换为完全培养基。乙醛刺激组给予不同浓度乙醛刺激，乙醛浓度分别为17.5μmol/L、87.5μmol/L、175μmol/L、350μmol/L、875μmol/L、1750μmol/L、2650μmol/L、3500μmol/L，刺激时间为24h，每12h补加乙醛一次;空白对照组加等体积培养基。各组培养24h后，加入5mg/ml MTT 200μl，37℃孵育4h，吸弃孔内上清液，各孔加入二甲基亚枫200μl，低速震荡10min，以溶解被还原的MTT结晶，用酶标仪双波长（测定波长490nm，参考波长630nm）检测各孔吸光度值，计算不同浓度下乙醛刺激HSC增殖率与存活率。

增值率=[(乙醛组A值/对照组A值)－1]×100%

存活率=(乙醛组A值/对照组A值)×100%

1.2.4 MTT法观察不同刺激时间乙醛对HSC增殖的影响:细胞计数、接种于96孔板中培养同上。乙醛刺激组选择最佳浓度350μmol/L，分别刺激12h、24h和36h，每12h补加一次乙醛，对照组加等体积培养基。各孔加5mg/ml MTT 200μl，37℃孵育4h，吸弃孔内上清液，各孔加入二甲基亚枫200μl，低速震荡10min，以溶解被还原的MTT结晶，酶标仪双波长(测定波长490nm，参考波长630nm）检测各孔吸光度值，计算乙醛刺激不同时间点的HSC增殖活性。

2 结果

2.1 MTT法观察不同浓度乙醛对HSC增殖的影响 MTT法检测结果显示，乙醛在17.5μmol/L至2650μmol/L浓度梯度下刺激HSC，均有较好的增殖率，和对照组比较，差异有显著意义(P＜0.01)，细胞存活率在100%以上，且以350μmol/L刺激增殖效果最好。但乙醛浓度增至875μmol/L以上时，细胞殖值率开始下降，且存活率低于100%;当乙醛浓度增至3500μmol/L时，细胞增殖率呈现负值，提示随着乙醛刺激浓度的增加，乙醛对HSC产生毒性反应。因此，选择增殖率和存活率均大于100%的浓度(350μmol/L)作为最佳实验浓度。见表1。

表1 不同浓度乙醛对HSC增殖及存活率的影响

2.2 MTT法检测乙醛刺激不同时间对HSC增殖的影响 选择乙醛刺激HSC增殖的最佳浓度，各组大鼠HSC培养12h、24h和36h，MTT法检测结果显示，对照组细胞增殖基本一致，乙醛组在加入乙醛后，细胞数量开始增加，随着刺激时间的延长增殖明显提高，和对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。乙醛刺激24h细胞增殖活性达高峰。表明350μmol/L刺激24h是大鼠HSC增殖的最佳浓度和最佳时间。见表2。

表2 乙醛刺激HSC增殖不同时间点的MTT测定结果[MTT法(A值)]

3 讨论

肝纤维化是各种慢性肝病发展为肝硬化的必经病理过程，而酒精性肝损伤是造成肝纤维化的主要病因之一。肝星状细胞活化、增殖在酒精性肝纤维化形成中起关键作用。研究表明，乙醇的代谢产物乙醛可刺激肝星状细胞增殖，是导致酒精性肝纤维化发生的关键因素[3]。本研究选择乙醛作为致病因子进行体外研究，通过MTT法观察乙醛刺激大鼠HSC增殖的最佳浓度和最佳时间。实验结果显示，在一定范围内乙醛刺激HSC增殖呈现先增后减的量效关系，350μmol/L乙醛刺激HSC的增殖率和存活率均达到最佳状态。实验结果进一步显示，选择350μmol/L乙醛作为刺激浓度作用于大鼠HSC，随着刺激时间的延长，HSC增殖亦呈现先增后减的时效关系，且24h是乙醛刺激细胞增殖的最佳时间。因此，选择350μmol/L乙醛刺激24h可以成为比较理想的体外酒精性肝纤维化实验模型，可为后续探讨酒精性肝纤维化的发病机制及防治作用的研究提供可靠的实验依据。

[1]赵箐.酒精性肝纤维化中肝星状细胞活化的机制研究进展[J].国外医学药学分册，2006,33(3):198-203.

[2]陈川宁，陶忠桦，李红.乙醛对大鼠肝星状细胞株HSC-T6激活、增殖及转分化的影响[J].泸州医学院学报,2011,34(3): 217-220.

[3]蒋明德，甘新宇，解方为，等.乙醛对大鼠HSC增殖及胶原基因表达影响的实验研究[J].西南国防医药，2002,12(2): 97-100.

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2013-04-28)