任培土，傅 宏

论著

Cyclin E和p53在胆囊癌组织中的表达及意义

任培土，傅 宏

目的:探讨p53和细胞周期蛋白E（Cyclin E）在胆囊癌组织中的表达及其意义。方法:采用免疫组化方法，检测p53和Cyclin E在胆囊癌组织中的表达状况，并以同期慢性胆囊炎组织作为对照。结果：p53和Cyclin E在胆囊癌组织中表达阳性率较慢性胆囊炎组高，在中-低分化胆囊癌组织中表达阳性率较高分化胆囊癌组织高，与肿瘤有无淋巴转移及肿瘤1年生存率无明显相关性；Cyclin E在晚期胆囊癌（Nevin III～V期）组织中表达阳性率较早期（Nevin I～II期）胆囊癌组织高,Cyclin E表达阳性的胆囊癌患者1年生存率较表达阴性者低（P＜0.05）。结论:检测分析p53和Cyclin E在胆囊组织中的表达，有助于对胆囊癌进行早期诊断和判断预后。

p53；细胞周期蛋白E；胆囊癌；免疫组织化学

胆囊癌发现晚，预后差，治疗效果不佳。随着分子生物学的发展，人们的认识从解剖学的整体水平，扩展到以细胞生物学、免疫学、遗传学为基础的细胞水平、核酸和蛋白质水平上。本研究通过同时检测p53和细胞周期蛋白E（Cyclin E）在胆囊癌组织中的表达，为胆囊癌恶性程度和预后的判断提供新的思路，进而探索有效治疗措施。

1 材料与方法

1.1 病例选择 随机选择2000年1月—2008年1月胆囊癌患者50例为研究对象，男21例，女29例；年龄34～81岁，平均64岁。选取同期慢性胆囊炎50例石蜡包埋的组织标本作为对照组，男23例，女27例；年龄32～80岁，平均60岁。准入标准：（1）临床诊断为胆囊癌；（2）经过手术，且存有石蜡包埋的组织标本。排除标准：（1）转移性胆囊癌；（2）合并有其他恶性肿瘤。两组基本资料比较，无统计学意义。

1.2 p53和Cyclin E表达的检测 采用EnVision TM、TRP/DAB，鼠/兔二步法染色。主要试剂：正常山羊血清购自博士德生物工程有限公司，一抗鼠抗人Cyclin E购自迈新公司，EnVision TM检测试剂盒购自基因公司。

结果判定：p53以镜下观察细胞核呈现棕褐色颗粒为阳性细胞。采用双盲法计阳性细胞。染色强度判定标准：未见褐色着色肿瘤细胞为（-），肿瘤细胞染色少于10%为弱阳性（+），10%～50%为中度阳性（++），50%以上为强阳性（+++）。Cyclin E以细胞核内出现棕黄色至深棕色颗粒为阳性细胞，Cyclin E染色结果阴性（-）为阳性细胞率＜5%，阳性（+）为阳性细胞率＞5%。

1.3 数据收集 收集p53和Cyclin E在不同组织中的表达，以及胆囊癌的病理类型、肿瘤分化程度、Nevin分期、是否转移以及患者性别、年龄和预后。

1.4 统计分析 对获取的数据加以汇总，并进行统计分析，统计学处理计量资料均以均值±标准差表示，计量数据采用t检验，计数数据采用χ2检验。以P＜0.05为显著性差异标准。

2 结果

两组病人均检测p53和Cyclin E在胆囊癌组织中的表达。p53在胆囊癌中的表达如图1示；Cyclin E在胆囊癌中的表达如图2示。

图1 p53在胆囊癌组织中表达（×200）

图2 Cyclin E在胆囊癌组织中表达（×200）

2.1 p53在胆囊癌和胆囊炎组织中的表达 p53在胆囊癌组织中表达阳性率为64%(32/50)，胆囊炎组织中阳性率为2%(1/50)，两者有显著性差异（P＜0.05）。p53在中-低分化胆囊癌组织中表达阳性率为78%（29/37），高分化胆囊癌组织中阳性率为23%（3/13），两者有显著性差异（P＜0.05）。p53在早期（Nevin I～II期）胆囊癌组织中表达阳性率为64%（9/14），晚期胆囊癌（Nevin III～V期）组织中为64%（23/36），两者无显著性差异。p53在有淋巴或远处转移胆囊癌组织中表达阳性率为61%（14/23），无转移胆囊癌组织中为67%（18/27），两者无显著性差异。50例胆囊癌中5例失访。45例中p53阳性组的1年生存率为21%（6/29），p53阴性组为25%（4/16），两者无显著性差异。p53在不同病理类型胆囊癌中的表达因标本量较小，无法进行统计分析。

2.2 Cyclin E在胆囊癌和胆囊炎组织中的表达Cyclin E在胆囊癌组织中表达阳性率为42%(21/50)，胆囊炎组织中阳性率为6%(3/50)，两者有显著性差异（P＜0.05）。Cyclin E在中-低分化胆囊癌组织中表达阳性率为51%（19/37），高分化胆囊癌组织中阳性率为15%（2/13），两者有显著性差异（P＜0.05）。Cyclin E在早期（Nevin I～II期）胆囊癌组织中表达阳性率为14%（2/14），晚期胆囊癌（Nevin III～V期）组织中为53%（19/36），两者有显著性差异（P＜0.05）。Cyclin E在有淋巴或远处转移胆囊癌组织中表达阳性率为43%（10/23），无转移胆囊癌组织中为41%（11/27），两者无显著性差异。50例胆囊癌5例失访。45例中Cyclin E阳性组的1年生存率为3%（1/29），Cyclin E阴性组为56%（9/16），两者有显著性差异（P＜0.05）。Cyclin E在不同病理类型胆囊癌中的表达因标本量较小，无法进行统计分析。

3 讨论

胆囊癌的生物学性质非常恶劣，容易发生局部浸润和远处转移。加之起病隐匿，胆囊结石等在症状和体征上都对早期的胆囊癌有所掩饰，大部分胆囊癌在行剖腹探查时已经发展到进展期，手术往往难以切除，且对化疗、放疗不敏感，预后差，总体治疗效果不能令人满意。尽管近年来影像学诊断技术有了明显进步，但因该病的症状和体征缺乏特异性，确诊时疾病多属晚期。突破浆膜的晚期肿瘤，其生物学进程要比早期肿瘤快得多。不同恶性程度的肿瘤病人，其预后亦不同。因此，在临床工作中会有不同的治疗目的和思路，进而采取不同的治疗措施。如何更好地判断肿瘤的恶性程度和预后情况，从而为治疗措施提供依据，成为肿瘤工作者的目标。近几年，国内外学者对多种胆囊癌相关的分子生物学标记物如p53、Cyclin E等作了研究，围绕这些分子标记物的结构、功能和彼此间的相互关系，来逐渐阐明胆囊癌的发生、发展和转归，为基因治疗提供理论基础。

p53基因位于人染色体17p，长16～20 kb，有11个外显子和l0个内含子，编码53 KD的核蛋白，有转录因子的特征，控制细胞的代谢，DNA的修复和合成，编排细胞的死亡。p53分为野生型和突变型。由于p53野生型蛋白的半衰期短，利用免疫组织化学只能检测到突变型p53蛋白表达。p53基因是重要的肿瘤抑制基因，在体内作为转录因子，通过活化下游多种基因的表达，参与DNA损伤修复，又到细胞凋亡和分化，调控细胞周期和阻止细胞异常增殖。人类约50%以上的恶性肿瘤均有p53基因的异常改变。研究表明，胆囊癌中有较高频率p53基因缺失和突变[1]。大多数学者认为，p53基因和胆囊癌的增殖、恶性程度和预后有关[2-3]。

本研究结果显示，胆囊癌组p53蛋白显著高于胆囊炎组（P＜0.05），提示p53基因突变与胆囊癌变密切相关，在原发性胆囊癌的发生、发展过程中可能起重要作用。检测p53蛋白有助于原发性胆囊癌的临床诊断，并可作为胆囊的良性病变与恶性肿瘤相鉴别诊断的一个辅助指标。p53在中-低分化胆囊癌组织中表达阳性率较高分化胆囊癌组织高，且有显著性差异。可见p53的表达水平是判断肿瘤组织分化程度的一个重要客观指标，肿瘤细胞分化程度越低，p53阳性表达率越高，从而为判断肿瘤的恶性程度提供了依据。

本研究结果显示，p53在早期（Nevin I～II期）胆囊癌组织和晚期胆囊癌（Nevin III～V期）组织中，表达无显著性差异，与肿瘤有无转移及肿瘤1年生存率无明显相关性。提示p53的异常表达发生在胆囊癌的早期就存在，并且随着肿瘤的发展将持续存在。因此，检测p53的异常表达，有助于胆囊癌的早期诊断。

细胞的增殖分裂是细胞最基本的生理活动，细胞的增殖分化依赖于细胞有序的周期活动。目前已明确，在细胞周期活动中存在调控点，控制细胞周期进展的速度。肿瘤的发生与细胞周期增殖调节失控有密切关系。到目前为止，发现的细胞周期蛋白(cyclin，亦称之为循环素)有cyclin A、B、C、D、E、F、G、H等。Cyclin E是一类核蛋白，分子量约5×104，Cyclin E基因定位于19q12～13，有4个外显子和3个内含子。Cyclin E在细胞周期中呈明显的周期性表达，正常情况下Cyclin E合成于G1中期，至G1晚期Gl～S交界处含量达高峰，随后细胞进入S期。S期内Cyclin E经与“PEST”序列有关的蛋白分解或泛素化路径降解而迅速下降，到G2/M期降为零。目前普遍认为G1期Cyclin E是原癌基因。

本研究结果显示，Cyclin E在胆囊癌组织中表达阳性率较胆囊炎组织高，在中-低分化胆囊癌组织中表达阳性率较高分化胆囊癌组织高，在晚期胆囊癌（Nevin III～V期）组织中表达阳性率较早期（Nevin I～II期）胆囊癌组织高，Cyclin E表达阳性者1年生存率较表达阴性者低，且有显著性差异。可见Cyclin E在胆囊癌早期即有表达，且有Cyclin E阳性率越高肿瘤细胞分化程度越低、分期越晚、1年生存率越低的趋势。Cyclin E的检测解决了胆囊癌诊治过程中的不少难题，早期表达有助于早期诊断，而在分化差、晚期和生存率的胆囊癌患者中的高表达，表明Cyclin E阳性表达程度高可能提示预后不良。Cyclin E的过表达可加速细胞增殖周期，促进胆囊癌细胞异常增殖，在胆囊癌的发生发展过程中起重要作用。至于Cyclin E的过表达机制，目前尚未清楚。有人认为可能是由于DNA扩增所致。在没有基因扩增的肿瘤患者中，转录水平的改变和信号传导系统的上调与Cyclin E过表达有关。

本研究表明，p53和Cyclin E的表达与胆囊组织的良恶性、组织分化程度、胆囊癌的Neivin分期以及预后有关。两项指标结合分析，可更好地对胆囊癌进行早期诊断和判断预后。Cyclin E是细胞周期正性调控因子，是细胞进人S期的关键性调节基因，而p53出现于细胞的G1晚期，调节细胞由G1期进人S期。p53和Cyclin E的表达在胆囊癌的发生、发展过程中，可能通过协同作用导致肿瘤的发生与发展。但肿瘤的发展涉及多种相关基因的调控，癌基因的激活和/或抑癌基因的失活均可诱发肿瘤的发生和发展。p53的表达与Cyclin E的表达之间是否通过共同途径进而相互影响，其具体机制仍不十分明确，有待增加病例数进一步研究。

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（收稿：2012-12-26 修回：2013-04-08）

（责任编辑 孔 棣）

The Expression of p53 and Cyclin E in Gallbladder Carcinoma Tissues

REN Pei-tu,FU Hong Depart⁃ment of Hepatobiliary Surgery of Shaoxing People’s Hospital,Shaoxing(312000),China

ObjectiveTo explore the expression of p53 and Cyclin E in gallbladder carcinoma tissue and their significance.MethodsThe expression of p53 and Cyciln E in gallbladder carcinoma were detected by immunohistochemical technique and 50 cases of chronic cholecystitis tissues were collected as control.ResultsThe positive expression rate of p53 and Cyclin E was higher in gallbladder carcinoma than that in chronic chole⁃cystitis tissues.It was also higher in mid-low differerentiated gallbladder carcinoma than that in high differerenti⁃ated tissues.The expression of p53 had no significant difference between the early stage gallbladder carcinoma (Nevin I and II)and advanced stage(Nevin III-V)in while Cyclin E had.The lymphatic metastasis was not relat⁃ed with the expression of p53 and Cyclin E.The 1-year survival rate was not related with the expression of p53, but it was higher in patients whose Cyclin E were negative than positive ones.ConclusionAnalysis of expres⁃sion of p53 and Cyclin E is helpful to the early diagnosis and prognostic indication of gallbladder carcinoma.

p53;Cyclin E;immunohistochemistry;gallbladder carcinoma

R735.8

A

1007-6948(2013)05-0487-03

10.3969/j.issn.1007-6948.2013.05.001

浙江省绍兴市人民医院，浙江大学绍兴医院肝胆外科（绍兴 312000）

任培土，E-mail：sxrenpeitU@l63.com