朱雪梅，阮 霞，胡蒋宁,*，白春清，熊 华，邓泽元

(1.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；2.南昌大学生命科学与食品工程学院，江西 南昌 330031)

α-生育酚、VC 硬脂酸酯和槲皮素在含松籽油酸结构脂中抗氧化作用的研究

朱雪梅1,2，阮 霞1，胡蒋宁1,2,*，白春清1，熊 华1，邓泽元1

(1.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；2.南昌大学生命科学与食品工程学院，江西 南昌 330031)

通过Schaal烘箱(60℃)氧化法，比较α-生育酚(TOH)、抗坏血酸棕榈酸酯(AP)和槲皮素(Qu)对含有松籽油酸的软质黄油基料油(SL)的抗氧化作用。结果表明：经过30d的烘箱氧化后，SL中多不饱和脂肪酸的含量减少，其中功能性松籽油酸由7.10%降低到4.60%。AP和Qu能够有效降低多不饱和脂肪酸的氧化分解，并且显著抑制结构脂的过氧化值(POV)、酸值(AV)和硫代巴比妥酸值(TBARS)。AP和Qu的抗氧化作用随着添加量增加而增强。与低添加量(100mg/kg)TOH相比，高添加量(500 mg/kg)TOH有促进氧化作用，表现为增加酸值和硫代巴比妥酸值。另外，油脂氧化不仅改变了化学性质如脂肪酸组成、酸值、过氧化值和硫代巴比妥值等，而且改变了溶解和结晶曲线，添加抗氧化剂也对油脂氧化后的溶解结晶图谱有一定影响。

α-生育酚；抗坏血酸棕榈酸酯；槲皮素；软质黄油基料油；氧化稳定性

油脂中的多不饱和脂肪酸(PUFA)因含有不饱和键而不稳定，特别是受到光、热等作用容易氧化酸败变质，形成的氧化产物(如氢过氧化物和自由基)甚至进一步形成短链脂肪酸、醛类、酮类等物质，从而产生恶劣的酸臭味和异味，破坏油中所含的维生素等营养成分，直接影响油脂类食品品质和贮存期限。

松籽油含有不饱和脂肪酸＞90%，因含有特殊的脂肪酸-Δ5系列多不饱和脂肪酸(Δ5-PUFA，含量约为17%)而受到关注，其中松籽油酸(pinolenic acid)是松籽油中含量最多的Δ5-PUFA，约为14%[1-2]。药理实验表明含有Δ5-PUFA或Δ5-PUFA的松籽油有一系列的生物活性。Chen等[3]报道松籽油酸有抑制人乳腺癌细胞转移的作用；Ferramosca等[4]发现松籽油减轻小鼠体质量和降低血脂；Lee等[5]证实松籽油可以降低LDL，另外松籽油酸还有降血压和调节脂肪代谢的作用[6]。根据脂肪代谢原理甘油三酯中位于sn-2位置的脂肪酸被人体优先吸收，而松籽油中Δ5-PUFA选择性地分布在甘油三酯的sn-1、3位置，这一特性不利于Δ5-PUFA吸收利用从而会影响Δ5-PUFA的生物活性。因此有学者用松籽油为底物合成sn-2上富集Δ5-PUFA的结构脂[7-8]，本课题组[1]也以松籽油和棕榈酸硬脂酸酯合成无反式脂肪酸的人造奶油基料油。

然而，关于松籽油及相关结构脂的氧化稳定性的报道却很少。众多报道指出酯交换合成的结构脂有氧化稳定性降低的缺点[9]。因此，本实验的目的是通过添加α-生育酚(α-tocopherol，TOH)、抗坏血酸棕榈酸酯(ascorbly palmitate，AP)和槲皮素(quercetin，Qu)以提高合成后结构脂的氧化稳定性，并比较TOH、AP和Qu的抗氧化能力，采用DSC衡量氧化和不同抗氧化剂对结构脂的影响，并与经典油脂氧化评价标准(如过氧化值、酸值和硫代巴比妥酸值)进行比较。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红松仁购于当地市场。

Supelco 37脂肪酸甲酯混合标准品、松籽油酸脂肪酸甲酯标准品、三氟化硼(BF3)甲醇溶液、VE、VC硬脂酸酯、槲皮素、2,6-二叔丁基对甲酚(BHT) 美国Sigma公司；Lipozyme TLIM脂酶 丹麦诺维信公司；正己烷、异辛烷、乙醚(色谱纯) 美国Burdick & Jackson公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

HP6890气相色谱仪 美国Agilent公司；2000差示扫描热量仪 美国TA Instruments公司；UV-2450紫外分光光度计 日本岛津公司；FW100 型高速万能粉碎机北京科伟永兴仪器有限公司； RE-52AA 型旋转蒸发器上海申生科技仪器厂；DHG-9240型电热恒温鼓风干燥箱 江西鼎技科学仪器有限公司；HHS型电热恒温水浴锅 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；BS 224S型电子天平 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 松籽油的提取

以正己烷为提取溶剂并添加BHT(0.2mg BHT/g松籽)为抗氧化剂，在65℃条件下索氏提取2h并重复3次，最后减压蒸发蒸干溶剂，将提取得到的油于―20℃保存。

1.3.2 酶催化酯交换生产软质人造黄油

采用的酶催化酯交换反应方法是基于Zhu Xuemei等[1]优化后的方法。1L反应器中，称取棕榈酸硬脂酸酯400g并充分融化，加入松籽油400g混合均匀，加入210g脂酶。脂酶催化酯交换反应的搅拌速率是500r/min、温度60℃、反应时间3h。反应结束后用真空过滤出脂酶，因其酸价低于1.5g KOH/kg所以得到的结构脂(structured lipid，SL) 直接充N2保存。所得结构脂的物理特性已在文献[1]阐明。

1.3.3 烘箱氧化法

于50mL玻璃小瓶中称取15g酯交换反应生成的结构脂。TOH、AP和Qu溶解在乙醇溶液中配制一系列浓度，并且加入等体积不同浓度的不同抗氧化剂至已称取的样品中使抗氧化剂的添加量达到100、200、500mg/kg。充分混合后60℃条件下超声30min使抗氧化剂充分溶解在样品中，然后在加热60℃条件下用N2吹干乙醇，所得的样品放入烘箱中60℃条件下氧化30d。酯交换反应得到的SL加入等量的乙醇溶剂，但是不含有任何抗氧化剂，所有处理过程与添加抗氧化剂的样品一致。

1.3.4 总的脂肪酸组成及位置组成分析

称取50mg样品，加入1.5mL 0.5mol/L甲醇钠，充分混合后在95℃反应3min，冷却，再加入2mL 体积分数10% 的BF3甲醇溶液继续在95℃条件下反应2min，冷却后加入1mL饱和氯化钠和2mL异辛烷，提取脂肪酸甲酯经过无水硫酸钠干燥后用于气相(GC)分析。配有自动进样器和火焰离子化检测器，色谱柱为SP-2560石英毛细管柱(100mh0.25mm，0.2µm)。实验重复操作2次。GC分析条件：柱温先在100℃保温5min，采用程序升温以4℃/min升至220℃保持20min。载气为N2，总气体流速为52mL/min，进样口和检测器的温度分别为250℃和260℃。

1.3.5 过氧化值(POV)、酸值(AV)和硫代巴比妥酸值(TBARS)

烘箱氧化30d后，通过测定过氧化值、酸值和硫代巴比妥酸值等反应样品的氧化稳定性，测定方法参考AOCS Off i cial Method[10]。

1.3.6 差示扫描量热分析(DSC)

氧化30d后，样品的溶解和结晶曲线由差示扫描量热分析得到。准确称量5～10mg放入专用铝盒内，压紧密封，放入差示扫描热量仪内分析。空铝盒作空白参照。N2流速为20mL/min。首先，加热样品至80℃保持10min。随后，以10℃/min的速率降低温度到―60℃，持续10min后，再以5℃/min的速率再加热至80℃。

2 结果与分析

2.1 不同抗氧化剂对结构脂脂肪酸的影响

由表1可知，S L含有的主要脂肪酸是棕榈酸29.19%、油酸27.77%、亚油酸26.95%和松籽油酸7.10%，其中包括松籽油酸在内，共检测到8.74%的ΣΔ5-PUFA。在烘箱内氧化30d后，未添加氧化剂的对照剩余的脂肪酸含量有明显变化。饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸的含量增高，如棕榈酸增加为35.27%，油酸的含量增加到30.64%。而多不饱和脂肪酸的含量降低，如亚油酸的含量减少到18.82%，松籽油酸的含量降低到4.60%。同样ΣΔ5-PUFA的含量由氧化前的8.74%降低到6.11%。这些结果表明，多不饱和脂肪酸不稳定，在氧化过程中分解，导致含量降低，而饱和脂肪酸和单一不饱和脂肪酸相对稳定。因为参考其他大多数脂肪酸含量计算方法，采用面积归一化法，某一脂肪酸相对含量为该脂肪酸峰面积占总脂肪酸酯总峰面积的比例，所以多不饱和脂肪酸在氧化过程中分解比例(相对含量)降低导致饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的比例在总的脂肪酸中增加，这就是棕榈酸和油酸在氧化后含量有所增加。其他学者[11]也曾报道过类似的现象。另外，由表1也可看出，添加不同抗氧化剂对结构脂脂肪酸含量的影响。以∑PUFA为例，添加100、200mg/kg TOH的SL(分别为TOH100和TOH200)被氧化30d后剩余∑PUFA的含量分别为24.92%和24.13%，不仅低于未氧化的SL36.02%而且低于SL氧化30d的对照组25.27%；而添加500mg/kg TOH(TOH500)的SL氧化30d后剩余25.55%的∑PUFA。这些结果说明，100～500 mg/kg的TOH不能起到抑制脂肪酸氧化的作用。添加100、200、500mg/kg AP(AP100、AP200和AP500)，和100、200、500mg/kg Qu(Qu100、Qu200和Qu500)的SL氧化30d后，剩余的∑PUFA分别为26.52%、29.57%、35.10%和29.52%、32.97%、35.59%。氧化30d后，剩余的亚油酸、松籽油酸、ΣΔ5-PUFA以及ΣUFA的含量有类似的依次递减趋势，且顺序为SL＞Qu500＞AP500＞Qu200＞AP200＞Qu100＞AP100。剩余的PUFA含量越多，说明抗氧化剂的抗氧化能力越强，那么3种抗氧化剂的抗氧化能力从强到弱依次为：Qu＞AP＞TOH， 本实验证实Qu在油脂中的强抗氧化能力与已发表文献[12-13]一致，其中对Qu和AP来说，其抗氧化能力随着浓度的增加而增强，而TOH在100～500mg/kg随着其添加量变化没有明显规律可循且没有明显的抑制脂肪酸氧化的作用，说明对于以松籽油和棕榈酸硬脂酸酯为底物的SL来说，TOH抗氧化的最佳添加量范围并不是100～500mg/kg之内。

2.2 不同抗氧化剂对结构脂过氧化值的影响

表 1α-生育酚(TOH)、抗坏血酸棕榈酸酯(AP)和槲皮素(Qu)对脂肪酸含量的影响Table 1 Effects of α-tocopherol (TOH), ascorbyl palmitate (AP), quercetin and (Qu) on fatty acid composition

图 1α-生育酚(TOH)、抗坏血酸棕榈酸酯(AP)和槲皮素(Qu)对过氧化值的影响Fig.1Effects ofα-tocopherol (TOH), ascorbly palmitate (AP) and quercetin (Qu) on peroxide value

过氧化值通常用来反应初级氧化程度。由图1可知，过氧化值从高到低的排序是：AP100＞TOH100≈TOH200≈TOH500≈对照＞AP200≈Qu100＞Qu200＞AP500＞Qu500的抗氧化值最低，与SL的过氧化值差异最小。过氧化值越低，说明氧化程度越低，所添加的抗氧化剂的抗氧化能力越强。故抗氧化能力从强到弱的顺序是Qu500＞AP500＞Qu200＞AP200＞Qu100。过氧化值的变化一般分为缓慢增长期、对数增长期至最高值和减少期(过氧化物分解期)3个时期。从氧化30d后的脂肪酸组成来看，AP100有明显的抗氧化能力；而AP100的抗氧化值高于对照，并不表示AP100有促进氧化的作用，只能说明在本实验的取样点(30d)对照和TOH处理组的抗氧化值处于过氧化值减小期，而AP100处于过氧化值的对数增长期或者已经达到最大值。下面的酸值和硫代巴比妥酸值将会进一步证明这个推论。

2.3 不同抗氧化剂对结构脂酸值的影响

图 2α-生育酚(TOH)、抗坏血酸棕榈酸酯(AP)和槲皮素(Qu)对酸值的影响Fig.2 Effects of α-tocopherol (TOH), ascorbly palmitate (AP) and quercetin (Qu) on acid value

如图2所示，与过氧化值稍有差别，酸值(mg KOH/g)从大到小的顺序为：TOH500(2.88)＞TOH200(2.72)＞对照(2.69)＞TOH100(2.66)＞AP100(2.51)≥Qu100(2.42)＞AP200(2.38)＞Qu200(2.26)＞AP500(2.01)＞Qu500(1.90)。那么抑制酸值的能力刚好相反即Qu最强，其次是AP，TOH最弱。对AP和Qu来说，抑制酸值的能力随着浓度增高而增强；而100mg/kg TOH抑制酸值的能力却高于200、500mg/kg时。这说明，氧化30d后添加TOH的SL显示出较AP100更低的过氧化值并不是因为TOH有效抑制过氧化值，而是由于氧化时间过长过氧化物已经有部分分解。

2.4 不同抗氧化剂对结构脂硫代巴比妥酸值的影响

如图3所示，与酸值类似，所有SL添加TOH的硫代巴比妥酸值都高于对照。综合过氧化值、酸值和硫代巴比妥酸值的结果说明，高浓度的TOH有促进氧化的作用，类似结果也被Hraš等[14]报道。抑制硫代巴比妥酸值能力从大到小的顺序为：Qu500＞AP500＞Qu200＞AP200＞Qu100≥AP100＞对照＞TOH100＞TOH200＞TOH500，这个结果与抑制脂肪酸分解能力的结果一致。

2.5 氧化和不同抗氧化剂对溶解和结晶特性的影响

在油脂化学中，DSC被广泛地应用于测定油脂溶解和结晶的特性、固态脂肪含量、油脂结晶的晶型，甚至油脂的等级等[1,15-17]，而且DCS也是用来区分油脂级别的一种好方法[18]。另外DSC也可用于衡量油脂的氧化程度，Vittadini等[18]研究得到DSC与经典测量油脂氧化程度的方法如碘值、过氧化值、酸值和对茴香胺值等高度一致，Pardauil等[19]证明DSC与氧化稳定性指数有显著相关性，但是在国内尚未有用DSC反应油脂氧化或过氧化物的相关报道。由图4可知，SL有明显的4个溶解峰A、B、C和D。但是对照即SL氧化30d后的溶解曲线有明显差异，其中A峰消失，而溶解峰B变得更宽坡度更缓并且出现2个肩峰E和F，溶解峰D的变化趋势与B一致，同时整个溶解范围变宽(如图中虚线箭头所示)。不同抗氧化剂对溶解峰影响不同，AP500与Qu500溶解曲线与SL最相似，随着AP和Qu的添加量降低，相似度也降低。图5表示出了SL有G和H共2个结晶峰，氧化30d的SL对照的结晶峰明显比SL更钝，峰G坡度变缓，并且向高温度方向移动。添加AP和Qu的结构脂随着AP和Qu的添加量降低，峰G的坡度逐渐变缓，峰G和H峰高降低并向高温方向移动(如图中虚线箭头所示)，AP500与Qu500的结晶峰型与SL最相似。溶解峰和结晶峰变矮、溶解范围变宽(或坡度变缓)和高温位移等现象说明：1)经过30d氧化后结构脂中的甘油三酯水解，产生游离脂肪酸(图2)和部分甘油酯；2)氧化产生聚合物而导致黏度增加，如Vittadini等[18]报道。添加抗氧化剂特别是AP500和Qu500有效地抑制了SL溶解峰或结晶峰变宽变缓的现象。SL添加不同添加量TOH的融解曲线与对照高度相似，说明TOH的抗氧化能力在三者中最弱，与脂肪酸组成、过氧化值、酸值和硫代巴比妥酸值等结论一致。结果表明，DSC也可以作为衡量氧化程度或比较抗氧化剂强弱的有效方法之一[20]。

图 4α-生育酚(TOH)、抗坏血酸棕榈酸酯(AP)和槲皮素(Qu)对溶解热谱的影响Fig.4 Effects of α-tocopherol (TOH), ascorbly palmitate (AP) and quercetin (Qu) on melting thermogram

图 5α-生育酚(TOH)、抗坏血酸棕榈酸酯(AP)和槲皮素(Qu)对结晶热谱的影响Fig.5 Effects of α-tocopherol (TOH), ascorbly palmitate (AP) and quercetin (Qu) on crystallization thermogram

3 结 论

通过Schaal烘箱(60℃)氧化30d后的脂肪酸组成分析，实验所选用的软质黄油基料油不稳定，松籽油酸等多不饱和脂肪酸易氧化分解。脂肪酸组成与其他结果包括过氧化值、酸值、硫代巴比妥酸值和溶解结晶热谱等表明，Qu的抗氧化能力最强，其次是AP，且二者的抗氧化能力在100～500mg/kg范围内随着添加量增加而增强。TOH在本实验中没有表现出抗氧化作用，反而显示出一定的促进氧化的作用，其原因可能是添加量过高。与过氧化值等化学方法一样，溶解结晶图谱作为物理特性，也可以用来衡量油脂的氧化程度及抗氧化能力。

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Antioxidant Effects of α-Tocopherol, Ascorbyl Palmitate and Quercetin on Structured Lipid Containing Pinolenic Acid

ZHU Xue-mei1,2，RUAN Xia1，HU Jiang-ning1,2,*，BAI Chun-qing1，XIONG Hua1，DENG Ze-yuan1
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China；2. College of Life Science and Food Engineering, Nanchang University, Nanchang 330031, China)

The antioxidant effects of α-tocopherol (TOH), ascorbyl palmitate (AP), quercetin (Qu) on structured lipid (SL) were investigated through oven oxidation at 60 ℃. Polyunsaturated fatty acids (PUFA) revealed an obvious decrease, and the functional pinolenic acid decreased from 7.10% to 4.60% after 30 days of oven oxidation. AP and Qu could effectively protect PUFA from oxidation and signif i cantly reduce the peroxide, acid, and TBARS values. AP and Qu showed a dose-dependent antioxidant capability. Compared to a low concentration (100 mg/kg), TOH at a high concentration (500 mg/kg) revealed a slight promotion effect on oxidation, thus increasing acid and TBARS values. Besides, not only chemical characteristics including fatty acid composition and acid, peroxide and TBARS values, but also the melting and crystal prof i les of SL were affected by oxidation and added antioxidants.

α-tocopherol；ascorbyl palmitate；quercetin；soft margarine fat；oxidative stability

TS225.6；TS202.3

A

1002-6630(2013)01-0088-05

2011-11-15

第四批中国博士后基金特别资助项目(20110459)；江西省科技厅油脂加工与质量控制重点项目(赣科发2010J217)；国家自然科学基金面上项目(31071561)

朱雪梅(1982ü)，女，讲师，博士，主要从事功能性油脂和油脂化学研究。E-mail：zhuxuemei2005@gmail.com

*通信作者：胡蒋宁(1981ü)，男，讲师，博士，主要从事功能性油脂和食品营养研究。E-mail：hujiangning2005@hotmail.com