董 旭，杜先锋*

(1.安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所，农业部农产品质量安全风险评估实验室(合肥)，安徽 合肥 230022；2.安徽农业大学茶与食品科技学院，安徽 合肥 230036)

响应面法优化纤维素酶提取山核桃蒲多酚类物质

董 旭1，杜先锋2,*

(1.安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所，农业部农产品质量安全风险评估实验室(合肥)，安徽 合肥 230022；2.安徽农业大学茶与食品科技学院，安徽 合肥 230036)

利用纤维素酶法提取山核桃蒲多酚，在单因素试验的基础上，通过SAS统计分析软件，运用四因素三水平的响应面设计方法，建立纤维素酶法提取山核桃蒲多酚的二次多项数学模型，以提取率为响应值作响应面和等高线，最优浸提条件为pH6、浸提温度70℃、加酶量4U/g底物、浸提时间70min，此时的提取率预测值为63.43%，实际重复得出该条件下提取率为61.72%，相对偏差为2.77%。

山核桃蒲；纤维素酶；多酚；提取；响应面法

山核桃(Carya cathayensis Sarg.)，又名“小胡桃”、山核桃楸，主要产于皖南山区海拔300～900m及大别山区海拔800～1200m的针阔叶混交林中。浙江省天目山区也有分布，其中临安县西部昌化地区和淳安县北部有大面积的人工林[1]。山核桃果皮由外果皮、中果皮和内果皮三层结构组成，含叶绿体的表皮细胞紧密排列形成薄壁组织层，外表面有角质层，构成外果皮即为山核桃蒲，是山核桃加工过程中的废弃物。山核桃蒲壳与山核桃干子数量的比例约是4.5:1～5.5:1，据此可知每年的山核桃蒲壳的量至少可达30000t以上。每年山核桃采收的季节，大量的山核桃蒲壳废弃物堆积如山或直接倾倒在河里，对山区的自然环境造成了极大的污染[2-6]。

本研究在超细粉碎的基础上采用纤维素酶破坏其细胞壁[7]，使山核桃蒲壳中的多酚类物质充分释放，结合二次通用旋转设计方法，建立以多酚提取率为目标函数的数学模型，重点考察温度、时间、pH值和加酶量对多酚提取率的影响，为山核桃蒲的综合利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

山核桃蒲采自安徽省宁国市；没食子酸对照品 中国食品药品检定研究院；氢氧化钠、盐酸、碳酸钠 上海中试化工总公司；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠 西陇化工股份有限公司；纤维素酶 湖南尤特尔生化有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

DK-8D型电热恒温水槽 上海恒科科技有限公司；B-290型喷雾干燥机 瑞士Büchi公司；FS-450型超声处理器 上海生析超声波仪器有限公司；UV-2102C型紫外-可见光分光光度计 美国尤尼柯仪器有限公司；OPD-8型喷雾干燥机 上海大川原喷雾干燥设备有限公司；U-3010紫外-可见扫描仪 日本日立公司；HX-200A型高速中药粉碎机 浙江省永康市溪岸五金药具厂；RE-522AA旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 原料预处理

山核桃蒲洗净、烘干、经中药粉碎机粉碎后、过筛、密封备用。

1.3.2 山核桃蒲浸提液多酚成分的定性鉴定[8-9]

利用植物多酚的定性鉴定方法鉴定山核桃蒲浸提液中的多酚成分。

1.3.3 多酚含量的测定

采用Folin-Ciocalteu(FC)法[10-11]，以没食子酸为标准品，将100mg没食子酸对照品置于100mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，配制质量浓度1mg/mL的没食子酸对照品溶液。取1mL标准品溶液定容至100mL，后分别配制质量浓度为10、20、30、40、50μg/mL的没食子酸对照品溶液，按Folin-Ciocalteu法分别取上述溶液1mL，加入1mL磷钼钨酸试剂(现配)，加入8mL 7.5g/100mL的碳酸钠溶液混匀，40℃保持20min，在765nm[12]处分别测定吸光度并绘制标准曲线，以没食子酸标准溶液质量浓度为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，标准曲线方程为Y=4.44X + 0.0038，R2=0.9994。

1.3.4 纤维素酶酶活的测定[13]

1.3.4.1 原理

纤维素酶水解羧甲基纤维素分子中的β-1,4葡萄糖苷键，释放出还原糖(以葡萄糖计)，与3,5-二硝基水杨酸(DNS)反应产生颜色变化，颜色的变化程度与释放还原糖的量呈正比，在550nm测得的吸光度对照标准曲线(以葡萄糖为标准物)确定释放还原糖的量，从而计算出纤维素酶活力。

1.3.4.2 纤维素酶活力单位定义

1g酶粉(1mL酶液)于50℃、pH4.8条件下，每分钟水解1% CMC溶液产生1μmol还原糖的酶量定义为一个纤维素酶活力单位。

1.3.4.3 酶活计算公式式中：A为在标准曲线上对应的葡萄糖量/(mg/mL)；

D为酶液稀释倍数；t为反应时间/min；M为葡萄糖相对分子质量(180.2)；V为测定用酶液体积/mL。

1.3.5 多酚提取率计算公式

式中：m为每克原料中提取的多酚量/g；M为每克原料中的多酚含量/g。

1.3.6 单因素试验

考察了温度、时间、pH值、加酶量以及料液比对多酚提取率的影响，初步确定适宜的浸提条件。

1.3.7 浸提条件的探讨

在单因素试验所确定的适宜条件范围内，采用四因素二次通用旋转设计，以多酚提取率为响应值，通过考察上述4因素对多酚得率的协同影响来确定最优浸提条件，该设计采用SAS数据处理中的响应面进行分析。

2 结果与分析

2.1 山核桃蒲浸提液多酚成分的定性鉴定[14-15]

利用多酚类物质的理化性质，在山核桃蒲浸提液中分别加入明胶、三氯化铁、甲醛-浓盐酸、醋酸铅试剂，根据加入不同试剂所产生的试验现象判定浸提液中是否含有多酚类物质。

表1 定性分析试验结果Table1 Qualitative analysis of peel extract of Carya cathayensis Sarg

如表1所示，5组实验均呈阳性结果，可以判定山核桃蒲浸提液中含有多酚类物质。

2.2 山核桃蒲原料中多酚类物质的含量测定

精确称取1.0g山核桃蒲原料，加入体积分数50%的丙酮溶液50mL加热回流2h，过滤，将滤渣再加入50%的丙酮溶液50mL加热回流2h，如此反复至滤液中无多酚物质浸出，合并滤液，减压蒸馏除去丙酮后经Folin-Ciocalteu法测定，滤液中的多酚类物质为81.1mg，即山核桃蒲原料中多酚类物质的含量为8.1%。

2.3 纤维素酶活力测定

取3支25mL的刻度试管分别加入0.2mL的稀释酶液，再分别加入1.8mL CMC溶液，50℃水浴加热30min后加入DNS试剂2mL，摇匀后具塞，沸水水浴10min，冷却后于550nm波长处测定吸光度，从葡萄糖标准曲线计算还原糖的量[16]，带入纤维素酶活力计算公式，计算出纤维素酶实测活力为1530U/g。

2.4 不同提取方式下提取效果的对比

精确称取10g已粉碎的山核桃蒲原料，在浸提温度60℃、料液比1:10、浸提时间1h的基本条件下，分别考察了超声波辅助浸提(超声波功率为450W，超声处理方式为连续脉冲，处理时间1h)，酶法浸提(pH5.5；加酶量为：纤维素酶3U/g底物、果胶酶1U/g底物)及超声波辅助酶法浸提等提取方式，按照1.3.2节的测定步骤以吸光度为判定依据。见表2。

表2 不同提取方式对多酚物质提取效果的影响Table2 Effect of extraction methods on the extraction efficiency of polyphenols

由表2可以得出，纤维素酶的使用可以大大提高多酚物质的溶出量，在超声波辅助下的溶出量与单独使用纤维素酶时基本相当，综合考虑本实验选用纤维素酶法进行山核桃蒲多酚浸提。

2.5 单因素试验

以10g山核桃蒲为原料，考察温度、时间、pH值、加酶量以及料液比这5个因素对试验结果的影响，通过只改变一个因素，来比较各因素的浸提条件的范围。

2.5.1 浸提温度的选择

由于纤维素酶的适宜反应温度为40～70℃，因此选择40～80℃为温度单因素考察的范围。由图1可知，在60℃时多酚的提取率最高。在温度40℃～60℃时提取率随温度的升高而逐渐提高，当温度高于60℃时提取率却随温度的升高而逐渐下降，这说明随着温度的升高，酶的活性降低，同时过高的温度也会对已溶出的多酚类物质起到破坏的作用。

图1 浸提温度对多酚提取率的影响Fig.1 Effect of temperature on the extraction efficiency of polyphenols

2.5.2 浸提时间的选择

图2 浸提时间对多酚提取率的影响Fig.2 Effect of hydrolysis time on the extraction efficiency of polyphenols

在确定了浸提温度60℃的基础上，考察5个时间点对提取率的影响。由图2可知，多酚的提取率随时间的延长而逐渐增加，在30～60min时间段内提取率的增速极快，在60～120min时间段内提取率平稳增长，而从120min后提取率的增长量基本不变。因此选择浸提时间为120min。

2.5.3 pH值的选择

在确定了浸提温度60℃、浸提时间90min的基础上，同时考虑到纤维素酶反应的适宜pH值，选择5个pH值，考察5个不同pH值对提取率的影响。由图3可知，pH值为5～5.5范围时，提取率达到最高值，pH＞5.5时，提取率开始下降，到6.5时，趋于平稳，因此选择pH5.5作为较适酸度。

图3 pH值对多酚提取率的影响Fig.3 Effect of hydrolysis pH on the extraction efficiency of polyphenols

2.5.4 加酶量对提取率的影响

在确定了浸提温度60℃、浸提时间90min、pH5.5的基础上，考察5个不同加酶量对提取率的影响。由图4可知，加酶量在3U/g底物时提取率最高，1～3U/g底物时反应体系中底物充足，增长速度较快，4U/g底物以后提取率有所下降，这时酶解反应饱和，反应速率将不再增加反而会逐渐下降，使得酶有效利用率下降，所以选择纤维素酶用量选择3U/g底物。

图4 加酶量对多酚提取率的影响Fig.4 Effect of enzyme loading on the extraction efficiency of polyphenols

2.5.5 料液比对提取率的影响

在确定了浸提温度60℃、浸提时间90min、pH5.5、加酶量3U/g底物的基础上，考察5个不同料液比对提取率的影响。由图5可知，当料液比达到1:12时多酚的提取率最大，且从1:12开始提取率基本趋于稳定，因此选择料液比为1:12。

图5 料液比对多酚提取率的影响Fig.5 Effect of solid-to-liquid ratio on the extraction efficiency of polyphenols

2.6 试验设计及响应面分析

2.6.1 试验设计

图5 料液比对多酚提取率的影响Fig.5 Effect of solid-to-liquid ratio on the extraction efficiency o polyphenols

表4 响应面试验设计及结果Table4 Quadratic universal rotation combination design matrix and results

依据单因素试验结果，综合考虑各因素对山核桃蒲多酚提取率的影响，采用二次通用旋转组合设计法，以多酚提取率为响应值，对pH值、温度、加酶量和时间这4个因素优化设计，试验安排及结果如表3、4所示。

2.6.2 响应曲面法试验

表5 提取率的回归数学模型Table5 Regression coefficients and statistical significance of the fitted regression model

表6 模型方差分析Table6 Analysis of variance for the fitted regression model

响应曲面法试验设计及结果见表4，运用SAS数据统计分析软件对试验数据进行多元回归拟合，回归模型系数及显著性检验结果见表5。得到pH值(X1)、浸提温度(X2)、加酶量(X3)、浸提时间(X4)的二次多项回归模型：

响应数据的方差分析结果见表6，分析结果显示模型的F值=13.931＞F0.05(14,6)=2.85，P=0.0001＜0.01，表明回归模型显著，故可用上述回归方程描述各因子与响应值之间的关系(R2=92.42%)。由表5可知方程X1、X2、X3影响极显著，X4影响显著，且由表6可知，二次项极显著(P＜0.001)，说明响应面分析所选的主效应都达到显著水平。其中，因素之间的交互作用也较大(P＜0.05)。同时由F值和P值可以看出，在pH值、浸提温度、加酶量、浸提时间这4个因素中，pH值、浸提温度、加酶量对提取率影响最大，其次是浸提时间。失拟项F=0.829＜F0.05(14,10)=2.60，P=0.0858＞0.05，不显著，说明该模型拟合程度良好，试验误差小，可以用此模型来分析和预测山核桃蒲多酚提取的工艺结果。模型的响应曲面及等高线见图6、7，两组图直观地反映了各因素对响应值的影响。

图6 pH值、加酶量对多酚提取率的响应面图和等高线图Fig.6 Response surface and contour plots for the effect of pH and enzyme loading on the extraction efficiency of polyphenols

图7 温度、加酶量对多酚提取率的响应面图和等高线图Fig.7 Response surface and contour plots for the effect of temperature and enzyme loading on the extraction efficiency of polyphenols

2.6.3 浸提最佳条件优化与验证

运用SAS软件的响应曲面优化设计对试验结果进行优化，考虑到实际生产中的条件，选择最优浸提条件为pH6、浸提温度70℃、加酶量4U/g底物、浸提时间70min，预测山核桃蒲多酚的提取率为63.43%。

为检测响应曲面法所得结果的可靠性，采用上述优化条件进行重复实验，在上述条件下实际提取率为61.72%。与预测值相比，其相对偏差约为2.77%，说明可以利用上述回归方程对实际浸提进行预测和控制。因此，基于响应曲面法所得的优化工艺参数准确可靠，具有实用价值。

3 结 论

试验结果表明在单因素试验的基础上，采用SAS统计分析中的二次通用旋转组合，进行响应面分析，建立了山核桃蒲多酚提取工艺中pH值、温度、加酶量和浸提时间对提取率的数学模型。通过方差和可信度分析表明，模型拟合度较好。通过响应面优化分析，确定最优浸提条件为pH6，浸提温度70℃、加酶量4U/g底物、浸提时间70min，预测山核桃蒲多酚的提取率为63.43%。实际重复得出该条件下实际提取率为61.72%。与预测值相比，其相对偏差约为2.77%。在最优浸提条件下的验证试验表明，建立的数学模型可以完全模拟山核桃蒲多酚的提取过程。

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Optimization of Cellulase-Assisted Extraction of Polyphenols from Carya cathayensis Sarg Peels by Response Surface Methodology

DONG Xu1，DU Xian-feng2,*
(1. Key Laboratory of Agro-Product Safety Risk Evaluation (Hefei), Ministry of Agricultrue, Institute of Plant Protection and Agro-Products Safety, Anhui Academy of Agricultural Sciences, Hefei 230022, China；2. College of Tea & Food Science and Technology, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China)

Response surface methodology was employed to optimize the cellulase-assisted extraction of polyphenols from Carya cathayensis Sarg peels. A regression model was established based on a four-variable, three-level quadratic universal rotation combination design using SAS software. Response surface and contour plots were drawn for the extraction efficiency of polyphenols as a function of four operating parameters. The optimum extraction conditions were found to be pH 6, 70 ℃, 70 min and4 U/g for enzyme loading. Under the optimized conditions, the maximum predicted extraction efficiency of polyphenols was 63.43%, which was close to the actual average value of 61.72% with a relative error of 2.77%.

Carya cathayensis Sarg peels；cellulase；polyphenol；extraction；response surface methodology

TQ243.1

A

1002-6630(2013)04-0109-05

2012-02-08

董旭(1979—)，男，硕士，研究方向为农产品质量安全风险评估。E-mail：dongxu929@163.com

*通信作者：杜先锋(1963—)，男，教授，博士，研究方向为食品生物技术及农副产品深加工。E-mail：dxf@ahau.edu.cn