侯树刚,孙瑛,刘丽君,周畅,张晨

(青岛大学医学院附属医院神经内科,山东青岛 266003)

白三烯A4水解酶基因多态性与缺血性脑卒中相关性

侯树刚,孙瑛,刘丽君,周畅,张晨

(青岛大学医学院附属医院神经内科,山东青岛 266003)

目的探讨白三烯A4水解酶(LTA4H)基因多态性与缺血性脑卒中(IS)的关系。方法采用病例-对照研究、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法,检测380例IS病人和290例健康体检者(对照组)LTA4H-rs2660845位点的基因多态性。结果与对照组比较,IS组及其亚组的LTA4H-rs2660845基因型(AA、AG、GG)与等位基因(A、G)的分布频率差异无显著性(P＞0.05)。结论LTA4H-rs2660845基因多态性可能与IS的发病无关。

白三烯A4;脑血管意外;多态性,限制性片段长度

缺血性脑卒中(IS)具有高发病率、高致死率和高致残率等特点。动脉粥样硬化是IS发生和发展过程中的重要病理和生理基础。炎症反应是动脉粥样硬化的主要致病机制。白三烯(LTs)是一种重要的炎症递质,它能够激活白细胞,促进单核细胞与血管内皮细胞黏附,增加血管的通透性;并且还能促进动脉中膜平滑肌细胞发生增殖和迁移[1]。白三烯A4水解酶(LTA4 H)是LTs产生通路的重要的调节点,也是白三烯B4(LTB4)合成过程中的关键酶[2]。多项研究结果表明,LTA4 H基因多态性与哮喘、肿瘤、冠心病的发病相关[3]。本研究旨在探讨LTA4 H基因多态性与IS的相关性。现将结果报告如下。

1 对象与方法

1.1 对象及分组

1.1.1 病例组 2010年8月—2012年6月,选取在我科住院的IS病人380例,男248例,女132例;年龄46～82岁,平均(65.42±9.02)岁。均符合1995年中华医学会第四届脑血管会议制订的各类脑血管疾病诊断要点,经神经系统检查及CT或MRI检查确诊。排除因脑出血、蛛网膜下隙出血或血管炎性疾病等导致的脑梗死,因脑血管淀粉样变性、恶性肿瘤、血液病、血管畸形或动脉瘤等所引起的IS。病人入院后完善各项实验室检查,并行经颅多普勒超声(TCD)、颈部血管超声、CT血管造影(CTA)或磁共振血管成像(MRA)[4]等血管相关检查。由两名经验丰富的副主任医师根据病人临床症状、体征及各项检查结果行TOAST分型,其中大动脉粥样硬化型(LAA)308例,小动脉闭塞型(SVD)72例。其余类型不包括在此研究范围内。所选取的研究对象均有完整的临床资料,并签署知情同意书。

1.1.2 对照组 290例,为同期我院体检中心查体健康者,男189例,女101例;年龄55～76岁,平均(65.07±8.46)岁。经详细的病史询问及系统的体格检查后,排除脑血管病史及神经系统症状。

两组性别、年龄、低密度脂蛋白(LDL)比较,差异无显著性(P＞0.05);吸烟、高血压、糖尿病例数及HDL水平比较,差异均有显著意义(χ2＝6.322～36.732,t＝－2.143,P＜0.05)。见表1。

1.2 实验方法

1.2.1 标本采集及DNA提取 收集待检者清晨空腹静脉血4 m L,置EDTA抗凝管中,应用DNA提取试剂盒(Promega公司生产)提取DNA,核酸分析仪测定DNA浓度。

1.2.2 引物设计 根据LTA4 H-rs2660845位点的单核苷酸多态性(SNP)的已知序列设计PCR引物,并由上海桑尼生物科技有限公司合成引物。引物序列见表2。

1.2.3 PCR反应 反应体系10μL,内含:DNA模板1μL,Taq PCR Master Mix 5μL,上、下游引物各0.2μL,灭菌蒸馏水3.6μL。反应条件:95℃预变性5 min;94℃45 s;59℃45 s,72℃45 s,共35个循环;最后72℃延伸10 min。

1.2.4 酶切反应 体系为10μL,内含Bsh1236Ⅰ限制性内切酶0.3μL,Buffer 1μL,PCR扩增产物3μL,灭菌蒸馏水5.7μL。置于37℃温箱内14 h进行酶切反应。酶切反应产物经40 g/L琼脂糖凝胶电泳测定样本基因型。选取部分样本进行测序以确定酶切结果是否稳定可靠。酶切片段长度及基因分型见表2。

表1 两组临床资料比较(例(χ/%),±s)

___组别_____n______年龄(岁)_______男性________吸烟_______高血压糖尿病HD(c/mmol·L－1)LD(c/mmol·L－1)对照组290 65.07±8.46 189(65.2)84(29.0)136(46.9)62(12.8)1.30±0.32 2.66±0.70 __病例组___380___65.42±9.02____248(65.3)__136(35.8)__225(59.2)__117(30.8)______________________________________________ 1.26±0.31 2.81±0.76

1.3 统计学分析

应用SPSS 19.0软件进行统计学处理,计量资料结果以±s表示,数据间比较采用t检验;计数资料比较采用卡方检验;相关分析采用多因素Logistic回归分析。应用Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验两组基因频率是否符合遗传平衡定律。

2 结 果

PCR扩增LTA4 H-rs2660845基因位点产物长度为125 bp,被限制性内切酶Bsh1236Ⅰ酶切成3种带型,分别代表GG、AG、AA基因型(图1)。

Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验显示所选群体具有人群代表性(χ2＝0.191,P＞0.05)。病例组和对照组相比较,LTA4H-rs2660845位点AA、AG、GG基因型分布差异无统计学意义(P＞0.05), A、G等位基因分布差异无显著意义(P＞0.05)。LAA组、SVD组与对照组比较,AA、AG、GG基因型分布差异无显著性(P＞0.05),其等位基因A、G分布差异亦无显著性(P＞0.05)。见表3。

多因素Logistic回归分析去除高血压、糖尿病、吸烟、HDL-C的影响后,病例组和对照组LTA4H-rs2660845位点基因型AA、AG、GG分布差异无显著性(P＞0.05),等位基因A、G分布差异无显著性(P＞0.05))。LAA组、SVD组与对照组比较,基因型AA、AG、GG分布以及等位基因A、G分布差异均无显著性(P＞0.05)。

3 讨 论

已有研究结果显示,LTA4 H位于细胞浆中,其相对分子质量约为69 285,具有氨基肽酶和水解酶的双重活性,水解酶抑制剂可以抑制其活性[5]。LTA4H是LTB4合成的限速酶,LTA4既能转化成具有致炎作用的LTB4,也能转化成具有支气管和血管收缩作用以及致炎作用的半胱氨酸白三烯(Cys LTs),即LTC4、LTD4和LTE4。Cys LTs能够增加血管内皮细胞的通透性,参与信号转导,促进动脉管壁白细胞的聚集,导致血管重塑和血栓形成[6]。已有动物研究结果显示,大鼠局灶性脑缺血后Cys LTs含量有所增加,Cys LTs的释放可以被FLAP抑制剂所抑制,从而减小脑梗死体积[7]。由此可见,Cys LTs参与了某些炎症反应及中枢神经系统疾病的病理进程。

LTA4 H是由LTA4 H基因编码合成的,该基因位于人类染色体12q22,含有19个外显子和18个内含子,负责合成含有611个氨基酸的蛋白质。不同地区和人群中关于LTA4H基因与动脉粥样硬化性疾病相关性的研究结论并不完全一致。QIU等[8]研究显示,人类动脉粥样硬化斑块中LTA4H m RNA的表达增加,并且其表达量与斑块不稳定性呈正相关,即其表达的量越多斑块就越不稳定。de-CODE研究小组研究显示,Hap K为编码LTA4H基因的单倍体,携带Hap K人群心肌梗死的发病率高于对照组:在冰岛人群中,心肌梗死病人中携带Hap K者约占14.5%,明显高于对照人群的携带率(10.4%);而且经过伊屋诺霉素刺激后,心肌梗死病人的粒细胞可以产生更多的LTB4;在美国人群中,非洲裔美国人携带Hap K频率比欧洲裔美国人低,但是携带Hap K使非洲裔美国人心肌梗死发病风险提高3.57倍,欧洲裔美国人心肌梗死发病风险提高1.16倍[9]。最近一项研究显示,Hap K能使高加索人群患冠心病的风险提高1.2倍[10]。BEVAN等[11]对872例英国IS病人和601例德国IS病人研究显示,LTA4 H基因的表达使小血管发生病变的风险提高1.041～2.262倍,LTB4受体复合物的单倍体型使心源性卒中的风险提高1.194～3.760倍,白三烯通路成员及其受体的遗传变异增加了这两个种群IS的发病风险,而且发病风险的高低取决于IS的亚型。各文献结果不一致,原因可能与样本量的选择、样本的遗传因素和环境因素的影响不同有关。

本文研究结果显示,病例组和对照组LTA4H-rs2660845基因型AA、AG、GG和等位基因A、G频率分布差异无统计学意义,LTA4H-rs2660845位点基因多态性与IS的发生无相关性,病例组各亚组基因型、等位基因分布差异也无统计学意义。这与张晶[12]的研究结果一致。由于条件的限制,本文没有对所研究人群血液中LTs浓度进行测定,如能对研究人群血液LTs浓度进行测定,可以更好地了解该基因位点变异与IS发病机制的关系。

综上所述,LTA4H-rs2660845位点基因多态性与IS的发生无相关性,未发现LTA4 H-rs2660845基因多态性能增加IS的发病风险。

[1]LIBBY P.Inflammation in atherosclerosis[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2012,32(9):2045-2051.

[2]孙蕾,李聪,宋博,等.ALOX5AP基因多态性与缺血性脑卒中的相关性[J].青岛大学医学院学报,2012,48(3):207-210.

[3]HOLLOWAY J W,BARTON S J,HOLGATE S T,et al.The role of LTA4H and ALOX5AP polymorphism in asthma and allergy susceptibility[J].Allergy,2008,63(8):1046-1053.

[4]郭星宏,赵仁亮,王雁,等.急性脑梗死改良TOAST分型的影像学表现[J].齐鲁医学杂志,2010,25(4):321-323,326.

[5]王国峰,赵霞,杨传华.5-脂氧酶信号通路与动脉粥样硬化的关系[J].中华临床医师杂志:电子版,2011,21:6398-6401.

[6]ZHAO L,MOOS M P,GRÃBNER R,et al.The 5-lipoxygenase pathway promotes pathogenesis of hyperlipidemia-dependent aortic aneurysm[J].Nature Medicine,2004,10(9): 966-973.

[7]CICERI P,RABUFFETTI M,MONOPOLI A,et al.Production of leukotrienes in a model of focal cerebral ischaemia in the rat[J].British Journal of Pharmacology,2001,133(8): 1323-1329.

[8]QIU H,GABRIELSEN A,AGARDH H E,et al.Expression of 5-lipoxygenase and leukotriene A4 hydrolase in human atherosclerotic lesions correlates with symptoms of plaque instability[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2006,103(21):8161-8166.

[9]HELGADOTTIR A,MANOLESCU A,HELGASON A,et al.A variant of the gene encoding leukotriene A4 hydrolase confers ethnicity-specific risk of myocardial infarction[J].Nat Genet,2006,38(1):68-74.

[10]HARTIALA J,LI D,CONTI D V,et al.Genetic contribution of the leukotriene pathway to coronary artery disease[J].Hum Genet,2011,129(6):617-627.

[11]BEVAN S,DICHGANS M,WIECHMANN H E,et al.Genetic variation in members of the leukotriene biosynthesis pathway confer an increased risk of ischemic stroke:a replication study in two independent populations[J].Stroke,2008, 39(4):1109-1114.

[12]张晶.ALOX5与LTA4H基因多态性与中国华东地区脑卒中易感性的分子流行病学研究[D].南京:南京医科大学,2011.

(本文编辑 黄建乡)

THE RELATIONSHIP BETWEEN LEUKOTRIENE A4 GENE POLYMORPHISM AND CEREBRAL ISCHEMIC STROKE

HOU Shugang,SUN Ying,LIU Lijun,ZHOU Chang,ZHANG Chen (Department of Neurology,The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College,Qingdao 266003,China)

ObjectiveTo explore the relationship between leukotriene A4 hydrolase(LTA4H)gene polymorphism and cerebral ischemic stroke(CIS).MethodsBy employing a case control study,the LTA4H-rs2660845 gene polymorphism in 380 CIS patients and 290 healthy subjects were detected by using polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP).ResultsCompared with the control group,the differences of distribution of LTA4H-rs2660845 genotype(AA, AG,GG)and allele frequencies(A,G)in CISgroup and its subgroup were not significant(P＞0.05).ConclusionThe polymorphism of LTA4H-rs2660845 is unlikely to be involved in the development of CIS.

leukotriene A4;cerebrovascular accident;polymorphism,restriction fragment length

R743

A

1008-0341(2013)04-0325-03

10.11712/qlyx201304014

2013-02-28;

2013-06-13

山东省自然科学基金资助项目(ZR2010HM061)

侯树刚(1985-),男,在读硕士研究生。

张晨(1957-),男,教授,硕士生导师。