李 恒，王宏心，朱天瑞，李晓红

(山东大学附属济南市中心医院神经内科，山东济南250013)

多巴胺(dopamine，DA)神经元是中枢神经系统的一种重要神经元，控制躯体的姿势和肢体自主运动，调节机体的精神、情绪活动DA 神经元主要分布于中脑黑质的致密部(SNc)、腹侧被盖区(VTA)、红核后区(RRF)，其变性和缺失可以导致帕金森病的发生。目前的药物、手术仅限于控制症状，不能纠正DA 神经元的变性、缺失。具有向DA 神经元分化潜能的干细胞，可以通过移植替代变性缺失的DA 神经元达到治疗疾病的目的。自20世纪80年代开展的胎脑干细胞移植治疗帕金森病的临床试验，证实了这一技术的可行性和有效性［1－2］。进而，通过体外实验探讨不同来源干细胞向DA 神经元的分化潜能以及提高分化效率的诱导方法，成为目前干细胞研究的一大热点。本文将对目前体外实验研究中所采用的方法进行综述和比较，探讨不同来源干细胞向DA 神经元分化的潜能和有效诱导途径。

1 细胞因子

1.1 细胞诱导因子

根据胚胎干细胞向DA神经元分化过程中的基因调控特点，采用几种重要细胞因子调控特异性基因表达，可以促进干细胞向DA 神经元分化。常用的细胞诱导因子主要有音猬因子(sonic hedgehog，SHH)、成纤维生长因子(fibroblast growth factor，FGF8)、无翅畸形整合小鼠乳腺肿瘤同源基因位点1 因子(wingless-type MMTV integration site family member1，Wnt1)。在胚胎的发育过程中，FGF8 在菱脑峡(中脑和后脑的交界区)表达，SHH 在室管膜区(ventricular，VZ)表达，两者的相互作用决定中脑DA 神经元的产生［3］。因此，通过采用上述细胞因子联合诱导的方法，在多种来源干细胞体外向DA神经元诱导的实验中取得了成功。

SHH、FGF8 联合诱导可以促进碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)扩增的第2 代人胚胎神经干细胞向DA 神经元分化，达到大约66%的分化效率(总分化率)，通过立体定向法将分化细胞移植至帕金森大鼠模型的中脑黑质区，促进了动物模型疾病的恢复，但移植后的细胞仅有少部分表达DA 转运体，说明移植的细胞并没有完全分化为成熟DA 神经元［4］。

SHH 和FGF8 同样可以诱导成体间充质干细胞高效地分化为DA 神经元，通过采用bFGF 扩增并序贯加入SHH、FGF8 的方法，在Neurobasal + B27 的纹状体神经细胞培养基中诱导，可以促进大约67%的人骨髓间充质干细胞分化为DA 神经元，进一步加入胶质细胞源性神经生长因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)培养，可以促进成熟DA 神经元的钠、钙离子通道表达［5］。国内实验证实采用bFGF、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、SHH、FGF8 等序贯诱导的方法也可以促进人脐带间充质干细胞分化为DA 神经元，不同于上述骨髓间充质干细胞诱导方法的是诱导时间和SHH 的剂量相对较少，使用的N2 神经培养基未加入B27 添加剂(含维甲酸等促神经分化的成分)，因而DA 神经元的分化效率相对较低［6］。

1.2 神经生长因子

GDNF 和脑源性神经生长因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)主要促进DA 神经元的存活和成熟，在体外干细胞诱导实验中多与其他诱导剂联合使用［5，7－10］，也有体外实验证实GDNF 同白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)联合应用可以促进胚胎神经干细胞分化为具有DA 递质释放能力的成熟DA 神经元，其中GDNF 在分化中发挥了关键的诱导作用［11］。

2 化学诱导剂

2.1 糖原合成酶-3β 抑制剂

CHIR99021 是一种糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)的选择性抑制剂，通过激活Wnt 信号通路［12］，促进DA 神经元分化重要调控因子-同源框转录因子LMX1A(LIM homeobox transcription factor-1a)以及FOXA2 的表达，同SHH和FGF8 联合作用可以明显提高胚胎干细胞向成熟DA 神经元的分化效率，通过细胞移植治疗促进了小鼠、大鼠、恒河猴3 种帕金森动物模型疾病的恢复［13］。另外，国内的研究证实CHIR99021 协同SHH、FGF8 也可以促进人和猴来源的ips 细胞分化为成熟的DA 神经元［14］。

2.2 腺苷酸环化酶激活剂

腺甘酸环化酶激活剂forskolin 可以提高细胞内环磷酸腺苷cAMP 的水平，通过激活上游转录调控元件(cAMP response elements，CREs)促进DA 神经元特异性酪氨酸羟化酶基因的表达［15］。同GDNF、SHH、FGF8 联合应用可以促进大约10%的人牙髓神经干细胞分化为具有递质释放能力的DA 神经元［9］。近期的国内研究结果证明，采用SHH、FGF8联合，然后序贯加入福斯克林、GDNF 和坏血酸的联合诱导方法也可以促进成年大鼠骨骼肌来源的干细胞分化为DA 神经元［10］。

3 基质细胞或神经基质共培养

采用同基质细胞共培养的方法，可以促进干细胞向DA 神经元分化。常用的共培养细胞主要为胚胎基质细胞，如PA6 细胞系。有研究表明，PA6基质细胞分泌的SHH 细胞诱导因子，在DA 神经元的分化中发挥关键作用［16］;含有人胎脑基质(过滤细胞的中脑组织滤液)的培养基联合低氧刺激环境，同样可以促进人胚胎干细胞向DA 神经元分化［17］。

4 基因转染

目前研究证实:胚胎干细胞向DA 神经元的分化受多种调控因子影响，在分化的早期受维甲酸(retinoic acid，RA)、Wnt1/5a、SHH、TGF-β、FGF-8、Lmx1a/b 信号激活的影响，中期的分化受神经发生素(neurogenin2，Ngn2)、Mash1(mammalian achaeteschute homologue-1)、NK6 转录因子相关1(NK6 transcription factor related locus 1，Nkx6.1)、Sox2(sex determining region Y-box2)调控信号的影响，分化后期主要受Nurr1、En1/2 信号的激活和Ngn2 信号的下调影响［3］。

体外实验证实通过转染促神经元分化的bHLH(basic helix-loop-helix)家族的Mash1 基因，可以协同Nurr1 促进胚胎干细胞向具有DA 递质释放功能的成熟神经元分化，而转染Ngn1/2、NeuroD 则产生抑制分化的作用［18］。一般认为单纯转染Nurr1并不能够诱导成熟DA 神经元形成，但近期的实验证实通过调控基因转染的条件(去掉bFGF 扩增条件的第7 天，通过强力霉素适当下调Nurr1 的表达)也可以诱导胚胎干细胞向成熟DA 神经元分化，但所获得的DA 神经元数量有所下降［19］。体外实验证实Foxa2 不仅可以协同Nurr1 基因促进胚胎干细胞分化为成熟DA 神经元，还可以增加分化细胞对MPTP (1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶)和H2O2氧化应激的毒性耐受能力，进一步通过细胞移植至帕金森大鼠模型的纹状体区域没有发现异常肿瘤出现，并促进了大鼠行为学的改善［20］。

总之，大量体外实验证明不同来源的具有多向分化潜能的干细胞均具有向DA 神经元的分化潜能，在不同诱导刺激条件下表现出不同的分化效率。通过体外实验研究，选择一种更为高效、安全的诱导方法，提供一种来源广泛、成熟的、具有DA 神经递质释放能力的种子细胞来源，可以促进干细胞移植治疗在帕金森氏病的应用和推广。

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