李文超 综述 许瑞江 审校

解放军总医院 小儿外科，北京 100853

骺板是位于骨骺与干骺端之间的软骨组织，负责长管状骨的生长。骺板组织是长管状骨中最薄弱部位，在各种因素作用下容易出现骺板损伤。然而骺板自身修复能力欠佳，损伤的骺板组织常被骨组织修复，即骨骺和干骺端之间形成骨性连接(骨桥)。根据骨桥的产生部位及面积可导致不同程度的肢体短缩和成角畸形。临床上采用骨桥切除及各种材料填充的方法仅在治疗小面积(<30%)的骺板损伤中取得了一定的临床效果。随着组织工程技术的飞速发展，众多研究逐渐致力于促进骺板组织再生、防止骨桥形成，实验结果比较满意，现就其研究进展综述如下。

1 骺板组织结构及骨桥形成

依据骺板细胞的组织形态和生物学功能将其在解剖上分为：静止区、增殖区、肥大区和钙化区等[1]。静止区中含有大量前软骨干细胞，通过增殖分化形成典型的柱状结构并分泌Ⅱ型胶原及蛋白多糖等细胞外基质。之后在碱性磷酸酶、骨形态发生蛋白及甲状旁腺激素相关蛋白等多种因素共同作用下调节钙盐沉积，形成钙盐晶体向成骨方向分化，促进肢体生长[2]。

骨桥组织的形成机制尚不清楚。早期研究认为骨桥来源于静止区干细胞损伤或骨骺与骺板间的紊乱。后期研究显示在骨骺和干骺端之间的血流循环紊乱将引起骨桥组织形成。其中骨小梁表现为干骺端松质骨的软骨内成骨的形态学和分子学的特征[3]。Lee等[4]报道骨桥来源于BMSCs向成骨细胞直接分化；未发现Ⅱ型胶原、血管内皮生长因子及其他与软骨成骨相关的分子学特征。Xian等[5]研究显示前成骨干细胞在细胞因子作用下向成骨方向分化，此外，白介素和肿瘤坏死因子等炎症细胞及转化生长因子β1(TGF-β1)、碱性成纤维生长因子(bFGF)和胰岛素样生长因子1(IGF-1)等细胞因子能降低软骨形成转化因子Sox-9mRNA表达以抑制软骨细胞外基质的产生[6]。

2 组织工程骺板软骨修复骺板损伤

临床上主要采用骨桥切除，填充脂肪、肌肉和肌腱等生物材料以及骨蜡、骨水泥及多聚体硅胶等非生物材料。上述材料仅具有机械支持作用，不具备生长能力，临床效果欠佳。组织工程技术在治疗骺板损伤方面取得了良好的实验效果，能够促进骺板软骨再生，减轻患儿肢体的畸形程度。其中包括种子细胞、支架材料和细胞因子三个方面。

2.1 种子细胞 种子细胞包括骺板细胞、关节软骨细胞以间充质干细胞等，根据来源情况分为自体细胞、同种异体细胞和异种细胞。

骺板细胞：骺板细胞具有良好的组织来源及细胞生物学功能，成为组织工程骺板的首选细胞，也是修复骺板损伤的重要保障。自体骺板细胞应用广泛，然而存在着来源不足及二次损伤等缺点；同种异体细胞来源充分，然而可能引起传染性疾病或者免疫排斥反应。Bently等[7]采用同种异体骺板细胞修复骺板损伤模型，骺板细胞形成类似骺板组织的柱状结构。但是，有研究将骺板细胞直接植入羊胫骨骺板损伤模型，出现明显的骨桥组织并伴有炎症反应[8]。

关节软骨细胞： 关节软骨细胞的生物学功能与骺板细胞相似，分泌蛋白聚糖和Ⅱ型胶原等细胞外基质。Tobita等[9]采用自体膝关节软骨细胞复合胶原凝胶植入幼兔骺板损伤模型，组织学显示细胞合成细胞外基质，防止骺板早闭的发生。Lee等[10]将软骨细胞复合琼脂糖修复骺板损伤，影像学显示肢体生长阻滞及成角畸形得到明显纠正。然而，关节软骨不具备骺板组织的多层柱状结构，长时间体外培养和传代过程中难以维持细胞表型，容易出现细胞老化现象。

间充质干细胞： 间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一系列具有多向分化潜能、自身再生的细胞，来源于骨髓、滑膜、骨骼肌和脂肪组织。MCSs形成集落成纤维细胞，还表达众多细胞表面蛋白和标记(CD44，CD71，CD90，CD105，CD120a，CD124以及CD166)。骨髓、骨膜和脂肪来源的MSCs植入幼兔骺板损伤模型中，影像学显示胫骨的成角畸形得到明显纠正[11]。Yoo等[12]将软骨膜干细胞诱导的软骨细胞复合纤维蛋白球植入幼兔胫骨骺板缺损模型，可见簇状的类软骨细胞结构。Chen等[13]将BMSCS复合琼脂糖凝胶植入骺板损伤模型，组织学显示MSCs具有软骨分化潜能，形成柱状结构的类骺板组织，胫骨短缩及成角畸形得到明显改善。

2.2 支架材料 支架材料是种子细胞的生存环境和代谢场所，其组织结构和功能变化直接影响组织工程骺板的生物学功能。充填剂复合物或支架材料为种子细胞提供三维依附支架和力学环境，刺激MSCs的生长及向软骨方向分化，使种子细胞均匀分布及促进软骨细胞增殖。此外，支架材料填充骺板缺损能够延缓骨桥发生。

细胞基质材料分为天然支架、人工合成支架及两者的复合物，包括藻酸盐、胶原、聚乙醇酸、聚乳酸、透明质烷、聚壳糖、胶原-氨基葡萄糖聚合物、聚乳酸-透明质烷聚合物、透明质烷-壳聚糖复合水凝胶等。此外，可注射性或体内原位交联、聚合的材料也是良好的细胞携带材料及缺损填充支架，如琼脂糖、胶原、壳聚糖、藻酸钙和透明质烷。琼脂糖以良好的生物学功能在组织工程中得到广泛应用，琼脂糖能够促进骺板细胞进行整合修复、相互依附。琼脂糖凝胶复合骺板细胞能够修复骺板损伤模型，纠正肢体短缩及成角畸形[10]。

纤维蛋白凝胶源于血浆纤维蛋白原的交联结合作用，模拟生理凝血过程。纤维蛋白凝胶价格便宜、可降解，能够促进细胞和基质材料的同源性混合，且已获得批准在临床上广泛应用。纤维蛋白原和凝血酶的结合比例决定了纤维蛋白凝胶的微环境以及植入的MSCs的扩展速度、增殖及分化情况[14]。由于纤维蛋白的溶解作用，其稳定性欠佳，常需要联合应用抑肽酶等纤维蛋白溶解抑制剂以增加体内试验的稳定性和效力。抑肽酶能够通过促进糖胺聚糖及Ⅱ型胶原的表达来提高BMSCs的软骨诱导作用，而且纤维蛋白凝胶支持TGF-β1的软骨诱导作用。

壳聚糖具有可降解性、良好的生物相容性以及促进组织愈合等特点，为细胞提供三维培养环境，能够维持骺板细胞表型、防止细胞老化、促进细胞增殖及合成细胞外基质。壳聚糖作为MSCs的支架材料有效地修复幼兔50%的骺板组织缺损，维持骺板组织开放[15]。透明质烷是细胞外基质的重要组成部分，能够维持软骨结构及生物力学功能的完整性。透明质烷能够促进软骨细胞增殖、新陈代谢、生物合成以及凋亡，并且抑制破坏性的炎症细胞及蛋白酶的表达[16]。种子细胞黏附在透明质烷表面分泌细胞外基质，植入体内不产生任何炎症反应，且在4个月内完全降解。

不同支架材料联合应用与单独支架相比具有明显的优势。例如：多糖藻酸钙凝胶能够提高TGF-β促进MSCs软骨诱导作用；透明质烷和海藻酸钙复合具有剂量依赖性提高软骨方向的诱导作用[17]。醋化透明质酸和蛋白凝胶复合支架促进骺板细胞增殖、分化及分泌细胞外基质。透明质酸和明胶复合的水凝胶具有良好的生物相容性以及软骨诱导作用，能够模拟软骨外基质的天然环境。可注射性的交联凝胶易于使用，能够填充各种不同形状的缺损部位[18]。

2.3 细胞因子 细胞因子包括TGF-βs、IGF、bFGF、VEGF及PDGF等，在调节细胞增殖、分化以及生物学行为方面起着关键性作用。而且细胞因子在促进MSCs向软骨细胞方向分化以及细胞生物治疗方面同样发挥着重要作用[19]。TGF-β能够刺激MSCs向软骨细胞分化，促进Ⅱ型胶原和糖胺聚糖等软骨基质分子的表达；而且促进MSCs合成蛋白聚糖、接合蛋白、纤维调节、低聚物基质蛋白及核心蛋白多糖等软骨细胞外基质[20]。BMP-2在骺板周围软骨膜以及肥大区中高度表达，能够诱导Ⅱ型胶原基因的表达；BMP-4在体外实验中能够提高肌肉来源的干细胞向成骨分化的作用[21]。IGF促进骺板细胞成熟及合成细胞外基质，还具有抑制骺板细胞肥大，维持骺板细胞表型的作用[22]。此外，骺板细胞联合IGF植入软骨缺损区域能够促进修复组织形态学及生物机械方面的改善[23]。VEGF在肥大区细胞中高度表达，触发了骺板细胞钙盐沉积以及促进内皮细胞增殖、迁移和干骺端的血管侵入[24]。TGF-β和IGF-1联合应用能够在植入或内在MSCs中发挥有潜力的双重促进作用。高浓度的IGF-1能够提高TGF-β1诱导滑膜纤维组织中MSCs的软骨分化作用。

3 展望

组织工程骺板在治疗骺板损伤方面取得了一定的实验效果，然而仍存在着诸多问题有待进一步探索和研究，具体主要有以下几个方面：1)缺乏统一的评价标准：在不同的实验设计及实施过程中，对于骺板损伤的面积、部位及观察时间缺少统一的标准，对修复结果以及对照评定仍需进一步完善。2)支架材料的选择：支架材料是组织工程骺板技术成功的关键，良好的支架材料应具有良好组织相容性、合适的孔隙率、可降解性、三维立体结构、良好的材料-细胞界面、可塑性和一定的机械强度。3)细胞因子的应用：细胞因子在体内的各种信号途径发挥各种生物学作用，然而外源性的细胞因子价格昂贵限制了实验应用。软骨细胞内源性细胞因子以及细胞因子缓释作用或将成为研究焦点。4)构建良好的组织工程骺板：体外构建具有正常结构的组织工程骺板组织，同时维持骺板细胞的各种生理功能达到修复骺板损伤的目的将成为众多学者的研究方向。

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