邵 悦，张 琪，张 程，马 勇*

(渤海大学化学化工与食品安全学院，辽宁 锦州 121013)

瓠瓜又名长瓠、扁蒲、瓠子、蒲瓜、葫芦等，属葫芦科一年生草本植物[1]。瓠瓜中含有胰蛋白酶抑制剂，它能与相应的蛋白水解酶形成一定的动态平衡，调节生物体内许多重要的生命活动[2]。据报道，大豆[3]、豆豉胰蛋白酶抑制剂能促进胰腺释放胰岛素，从而降低血糖浓度[4]；大黄中胰蛋白酶抑制剂具有抗肿瘤、保肝利胆、改善肾功能、活血止血、降血脂等多方面的作用[5]。目前，对瓠瓜的研究主要集中在育种和种植[6-8]方面，对瓠瓜中脂肪、蛋白质、维生素、微量元素等常见成分的测定也有报道[9-12]，对于瓠瓜中胰蛋白酶抑制剂的研究，国内外报道较少。本实验从瓠瓜肉、瓤、籽等不同部位中提取胰蛋白酶抑制剂，并进行活性和含量的测定[13]，但由于瓠瓜皮、叶、茎的色泽较深，难于脱色，不便测定，本实验未作深入研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜嫩瓠瓜采自锦州闾山。

牛胰蛋白酶(1:250) 上海维编科贸有限公司；苯甲酰DL-精氨酸对硝基苯胺(BAPNA，纯度≥98%) 上海三杰生物技术有限公司；大豆蛋白酶抑制剂 国药集团化学试剂有限公司；二甲基亚砜、三-羟甲基-氨基甲烷(Tris)、无水氯化钙、盐酸、三氯乙酸、氢氧化钠等均为国产分析纯。

缓冲溶液：称取Tris 3.025g、CaCl2·H2O 1.26g，溶于400mL去离子水中，用1mol/L盐酸调pH值，使溶液在37℃时的pH值为8.2，以去离子水溶解并稀释至500mL。BAPNA[7]溶液：称取BAPNA 20mg溶于0.5mL二甲基亚砜中，并将缓冲溶液预热至37℃作为溶剂将上述试剂稀释至50mL。胰蛋白酶溶液：称取胰蛋白酶10mg，转移至500mL容量瓶，用0.001mol/L盐酸[7]20mL溶解，以去离子水稀释定容并混匀，活性单位数≥2500U/mg，pH5.0～7.0。

1.2 仪器与设备

RE 52-86A旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；PB-10 Sartorius酸度计、TU-1901双光束紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3 方法[13]

1.3.1 胰蛋白酶抑制剂抑制率测定

以BAPNA为底物，建立一个特定的酶反应体系。胰蛋白酶可催化水解BAPNA，引起410nm波长处吸光度增加；胰蛋白酶抑制剂加入上述体系后，抑制了胰蛋白酶的活性，使吸光度增加的幅度有所减少，以其减少程度表示抑制剂的抑制能力，从而计算出抑制活性，其中抑制活性定义为：每克蛋白质抑制纯胰蛋白酶的毫克数[14-15]。

分别取鲜嫩瓠瓜肉、瓤、籽20g，磨碎，加入蒸馏水150mL，分别调节pH值至3、5、7、9、11，水浴加温提取。抽滤，减压浓缩至20mL，1000r/min离心20min，上清液即为样品提取液。

在10mL反应体系中，加1mL样品提取液，加蒸馏水至2mL，加入2mL胰蛋白酶溶液，振荡混匀，加入5mL BAPNA溶液，恒温37℃，反应10min后，立即加入1mL 30%三氯乙酸混匀，以终止反应，于410nm波长处测定吸光度。同时，以对应的空白溶液作为参照。按照式(1)计算抑制率。

式中：η为样品提取液对胰蛋白酶的抑制率/%；A0为胰蛋白酶溶液的吸光度；Ai为样品溶液的吸光度；Ab为样品溶液对照空白的吸光度。

1.3.2 胰蛋白酶抑制剂活性测定[16-17]

在空白试管中加入2mL蒸馏水、5mL BAPNA溶液，37℃水浴恒温10min后，加入1mL乙酸溶液、2mL胰蛋白酶溶液，混匀，过滤。

在酶反应试管中，分别加入稀释后的样品溶液1.0、2.0mL，各加入蒸馏水至2mL，水浴恒温37℃。加入2mL胰蛋白酶溶液，振荡混匀；加入5mL BAPNA溶液，37℃水浴恒温10min后，加入1mL 30%三氯乙酸溶液，混匀，以终止反应，过滤。用光程1cm比色皿，于410nm波长处测定吸光度，以对应的空白溶液作为参照。按式(2)、(3)计算胰蛋白酶抑制剂活性(TIU)和样品稀释液中胰蛋白酶抑制剂活性(T)。

式中：A标准为未抑制的酶反应体系的吸光度；A样品为抑制的酶反应体系的吸光度。

式中：TIU1.0、TIU2.0为分别加入稀释后的样品溶液1.0、2.0mL的胰蛋白酶抑制剂活性。因瓠瓜籽、肉和瓤均为固体，在此以TIU/g为抑制活性单位。

1.3.3 胰蛋白酶抑制剂含量测定[18-19]

采用BAPNA法测定瓠瓜胰蛋白酶抑制剂含量，配制5、10、20、30、40μg/mL的胰蛋白酶抑制剂标准溶液，以试剂空白作为参照溶液，在410nm波长处测定吸光度，测定其对胰蛋白酶的抑制率。以胰蛋白酶抑制剂质量浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作标准曲线，得线性回归方程：y=2.0393x－0.3082(R2=0.9994)，从而计算出样品中胰蛋白酶抑制剂的含量。

1.3.4 瓠瓜胰蛋白酶抑制剂提取单因素试验[20]

1.3.4.1 温度的影响

取磨碎的鲜嫩瓠瓜肉20g，按料液比1:6(m/V)加入蒸馏水120mL，pH7，温度分别为50、60、70、80、90、100℃，提取1h，过滤、离心后取上清液，减压浓缩到一定体积后测定对胰蛋白酶的抑制率。

1.3.4.2 料液比的影响

取磨碎的鲜嫩瓠瓜肉20g，pH7，温度70℃，料液比分别按1:2、1:4、1:6、1:8、1:10加入蒸馏水，提取1h，过滤、离心后取上清液，减压浓缩到一定体积后测定对胰蛋白酶的抑制率。

1.3.4.3 pH值的影响

取磨碎的鲜嫩瓠瓜肉20g，在70℃条件下，料液比按1:6加入120mL蒸馏水，pH值分别为4、5、6、7、8、9的条件下提取1h，过滤、离心后取上清液，减压浓缩到一定体积后测定对胰蛋白酶的抑制率。

1.3.4.4 时间的影响

取磨碎鲜嫩瓠瓜肉20g，温度为70℃，料液比按1:6加入120mL蒸馏水，pH7，提取时间分别为0.5、1、2、3、4h，过滤、离心后取上清液，减压浓缩到一定体积后测定对胰蛋白酶的抑制率。

1.3.5 瓠瓜胰蛋白酶抑制剂提取正交试验

以胰蛋白酶活性大小为指标，从温度、pH值、料液比、提取时间等条件中，选择对胰蛋白酶抑制剂提取率有显著影响的3项因素，进行L9(33)正交试验，探索从瓠瓜中提取胰蛋白酶抑制剂最佳条件。

1.3.6 测定瓠瓜不同部位的胰蛋白酶抑制剂的含量及活性

1.3.6.1 瓠瓜不同部位胰蛋白酶抑制剂活性的测定

分别取鲜嫩瓠瓜瓤、肉、籽的样品溶液，按1.3.2节方法测定其活性。

1.3.6.2 瓠瓜不同部位胰蛋白酶抑制剂含量测定

分别取鲜嫩瓠瓜瓤、肉、籽的样品溶液，按1.3.3节方法测定其含量，通过标准曲线得到不同部位的胰蛋白酶抑制剂的含量。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

图1 提取温度对提取液抑制率的影响Fig.1 Influence of temperature on trypsin inhibitor activity of extracts

由图1可知，随着提取温度的上升，胰蛋白酶抑制剂的抑制率逐渐增大；当样品的提取温度达到70℃时，抑制率达到最高；继续升高温度，胰蛋白酶抑制剂的活性受到抑制，使得抑制率逐渐降低。故选取提取温度70℃。

图2 料液比对提取液抑制率的影响Fig.2 Influence of solid-to-solvent ratio on trypsin inhibitor activity of extracts

由图2可知，随着加入蒸馏水的量不断增多，抑制率也随之增加，当料液比达到1:6时，抑制率达到最大且相对稳定，继续加入蒸馏水时，抑制率无明显变化。故选择料液比1:6。

图3 pH值对提取液抑制率的影响Fig.3 Influence of extraction pH on trypsin inhibitor activity of extracts

由图3可知，随着pH值的增大，抑制率逐渐增大，到 pH7时达到最大，继续增大pH值时，抑制率降低。因此，选择提取的pH值为7。

图4 提取时间对提取液抑制率的影响Fig.4 Influence of extraction time on trypsin inhibitor activity of extracts

由图4可知，在提取1h后提取液的抑制率没有太大的变化。综合考虑后选用提取时间为1h，并不将其作为正交因素。

2.2 正交试验

在单因素试验的基础上，采用料液比、提取温度、pH值三因素进行L9(33)正交试验，以测定样品提取液胰蛋白酶抑制剂抑制率为指标，试验设计方案及结果见表1。

表1 L9(33)正交试验结果Table 1 Factors and levels for orthogonal array design

由表1极值R可以看出，各因素对结果的影响次序为B＞C＞A，即pH值对抑制率影响最大，料液比次之，温度影响最小。由K值可以看出最优组合是A2B3C1，即最佳提取条件为：pH8、料液比1:4、提取温度70℃、提取时间1h，此条件下获得的抑制率最高达36.45%。

2.3 瓠瓜不同部位的胰蛋白酶抑制剂含量及活性测定

2.3.1 抑制剂含量测定结果

由图5可知，瓠瓜籽中胰蛋白酶抑制剂的含量最高为38.66μg/mL，瓠瓜肉中的含量次之为37.06μg/mL，瓠瓜瓤中的含量最少为25.33μg/mL。瓠瓜籽中的胰蛋白酶抑制剂含量最高是由于瓠瓜籽中水分含量很少，蛋白质含量较高。

图5 不同部位胰蛋白酶抑制剂含量Fig.5 Trypsin inhibitor content of different parts of gourd

2.3.2 抑制剂活性测定结果

图6 不同部位胰蛋白酶抑制剂活性Fig.6 Trypsin inhibitor activity of different parts of gourd

由图6可知，其中瓠瓜籽的抑制活性最高为29.8TIU/g，瓠瓜肉次之为28.3TIU/g，瓠瓜瓤最小为19.1TIU/g。

3 结 论

本实验确定了瓠瓜胰蛋白酶抑制剂的最佳提取条件，即pH8、料液比1:4(m/V)、提取温度70℃、提取时间1h；测定了瓠瓜不同部位的胰蛋白酶抑制剂含量，瓠瓜籽为38.66μg/mL、瓠瓜肉为37.06μg/mL、瓠瓜瓤为25.33μg/mL；测定了瓠瓜不同部位胰蛋白酶抑制剂活性，瓠瓜籽为29.8TIU/g、瓠瓜肉为28.3TIU/g、瓠瓜瓤为19.1TIU/g。

[1]倪克梁.百菜治百病[M].武汉: 湖北人民出版社, 2008: 98.

[2]谭竹钧, 沈明才, 张峰, 等.胰蛋白酶抑制剂的研究进展[J].广东工业大学学报, 2007, 24(3): 6-10.

[3]KENNEDYA R.The evidence for soybean products as cancer preventive agents[J].The Journal of Nutrition, 1995, 125: 7335-7339.

[4]郭瑞华, 王和平, 刘正猛.永川豆胰蛋白酶抑制剂的分离纯化及其降糖活性研究[J].时珍国医国药, 2007, 18(2): 299-230.

[5]刘同祥, 牛建昭, 杜旭东, 等.具有蛋白酶抑制活性成分中药的筛选[J].中国中药杂志, 2007, 32(7): 643-646.

[6]吴田铲, 丁兰.瓠瓜新品种“越蒲1号”[J].园艺学报, 2010, 37(1):163-164.

[7]高辉, 张绪聪.大棚无公害瓠瓜延秋高效栽培技术[J].农技服务,2009, 26 (12): 26-37.

[8]刘璇, 时祥柱.苦瓜籽中一种胰蛋白肽的分离及抗真菌作用观察[J].中国生化药物杂志, 2008, 36(1): 151.

[9]王希东, 石庆华, 古丽扎尔, 等.无种皮南瓜籽胰蛋白酶抑制剂的分离纯化与部分性质研究[J].新疆农业大学学报, 2007, 30(3): 36-39.

[10]周嘉裕, 廖海, 唐琳, 等.山合欢种子胰蛋白酶抑制剂纯化及部分性质研究[J].安徽农业大学学报, 2009, 36(1): 54-58.

[11]田军, 苏昌茂, 周先碗.甘薯和花生胰蛋白酶抑制剂的初步研究[J].广西植物, 2009, 29(1): 70-73.

[12]万善霞, 王婉琬, 滑静, 等.胰蛋白酶抑制剂在不同领域的研究概况[J].北京农学院学报, 2003, 18(2): 152-155.

[13]GODBOLE S A, KRISHNA T G, BHATIA C R.Purification and characterization of protease inhibitors from piheon pea (Cajanus cajan(L.) Millsp) seeds[J].J Sci Food Agric, 1994, 64(1): 87-93.

[14]AACC method 22-40.Measurement of trypisin inhibitor activity of soy products: spectrophotometric method[S].St.Paul: The American Association of Cereal Chemists, 1935.

[15]郭乾初, 梁汉华.商品大豆饮料胰蛋白酶抑制剂活性的研究[J].中国乳品工业, 1997, 25(6): 8-10.

[16]燕方龙, 华蕾.大豆制品中胰蛋白酶抑制剂的抑制活性测定[J].理化检验: 化学分册, 2007, 43(3): 226-228.

[17]黄凯, 郑田要, 朱建华, 等.大豆胰蛋白酶抑制剂的研究进展[J].江西农业学报, 2008, 20(8): 95-98.

[18]汤晓智, 敖宗华, 孙志浩, 等.太湖蓝藻水华胰蛋白酶抑制剂的含量测定[J].无锡轻工大学学报, 2001, 20(4): 418-420.

[19]傅中平, 周吉燕.苦瓜中胰蛋白酶抑制剂活性的测定方法研究[J].食品与药品, 2007, 9(4): 14-17.

[20]杜旭东, 刘同祥, 张宗申, 等.超声波法提取大黄胰蛋白酶抑制剂[J].时珍国医国药, 2008, 19(3): 525-527.