陈德综述，滕爱兰、周荣审校

Jennings[1]等最早于1960年提出心肌缺血再灌注损伤(Myocardial ischemia and reperfusion injury ，I/R)的概念，发现缺血再灌注会导致心律失常、心肌梗死面积扩大、持久性心室收缩功能低下，进而加速组织坏死的进程等。大量作用机制参与了心肌缺血再灌注损伤，并且不同机制之间存在交互的影响，本文就涉及氧化还原信号的保护机制研究进展进行综述。

1 心肌缺血再灌注损伤的多种作用机制

对心肌缺血再灌注损伤的机制研究已有较多报道[2]，其中急性缺血再灌注损伤涉及氧化还原的主要作用机制有：① 活性氧和活性氮（ROS/RNS）的生成；② 有效一氧化氮（NO）供应量的减少；③ Ca2+超载；④ 线粒体通透性转换 孔（Mitochondrial permeability transition pore，mPTP）的开放。这些机制会导致细胞的死亡，核转录因子(Nuclear factor κB，NFκB)和其他转录因子的激活会进一步增强细胞粘附分子的表达、白细胞浸润、无回流现象，更加加重组织损伤等。

1.1 活性氮和活性氧的生成

活性氮(RNS)包括亚硝酸根离子（NO2-）、过氧化亚硝酸阴离子（ONOO-）、次硝酸离子（HNO-），活性氧化剂(ROS)包括超氧离子（O2-）、过氧化氢（H2O2）、氢氧根离子（OH-），过量RNS和/或ROS的生成，导致氧化和抗氧化作用之间失衡，致使多种有害进程的发生。ROS能与脂类、蛋白质以及DNA任意反应：其与脂质反应生成H2O2和烷氧自由基，使脂质氧化；与蛋白质氨基酸残基侧链发生羰基化反应而变性蛋白质；与DNA发生氧化反应导致基因突变和DNA链断裂[3]。过量ROS /RNS对细胞功能和线粒体有害，在线粒体中，他们诱导mPTP的开放。然而，低水平的活性物质可以作为第二信使，通过共价修饰靶分子而调节氧化还原信号。

大量ROS/RNS释放而导致氧化和抗氧化作用的失衡，在心肌缺血再灌注损伤中涉及多种病理生理过程，最终导致心肌细胞死亡[4]。如O2-和其他氧自由基会使缺血的受损心肌细胞强烈氧化，导致细胞死亡。O2-还能与一氧化氮的负离子（NO-）反应生成ONOO-，在减少有效NO-供应的同时产生高细胞毒性[5]，并参与缺血再灌注损伤和心血管病理生理过程中由O2-诱导的心肌损伤。过氧亚硝酸盐与蛋白质、脂质及DNA反应使其化学结构改变而产生细胞毒作用，比如，过氧亚硝基使酪氨酸硝基化而灭活前列环素合酶，在心血管系统的病理生理过程中发挥了至关重要的作用。

线粒体是心肌细胞ROS和RNS的主要来源[6]，而ROS的大量释放与mPTP的参与有关。有研究表明[7]，离体心肌细胞中线粒体的去极化，伴随着mPTP的持续开放，释放出大量的ROS影响着细胞正常生理功能，二次化学反应物质最终诱发细胞毒作用。细胞器还可通过单胺氧化酶和衔接蛋白p66Shc的活化而产生大量的ROS。四氢生物喋呤、辅因子、L-精氨酸及其底物的缺失可使得NOSs解耦合从而产生O2-和 OH-[8]。

细胞可以通过胞内的抗氧化剂（如NO）以及氧化剂清除酶的协同作用，抵抗过量氧自由基的细胞毒副作用。超氧化物歧化酶（SOD）同工酶使得O2-转变成H2O2，亚铁离子（Fe2+）和铜离子（Cu2+）能使H2O2转变成OH-，而OH-的毒性要高于O2-和 H2O2，O2-还可以促使铁离子（Fe3+）复合物释放出Fe2+。因此，O2-有着直接和选择性的细胞毒性作用，亦或通过转变成OH而发挥细胞毒作用。O2-还可转换成ONOO-，而ONOO-可与NO产生二次化学反应生成亚硝基化物而降低其细胞毒性。适当调节ROS/RNS的水平可预防缺血再灌注损伤。在心肌缺血再灌注的过程中，我们可以通过增加NO水平，进而调节mPTP的开放和ONOO反应性，降低心肌细胞再灌注损伤而最终实现对心肌的保护效能。

1.2 有效一氧化氮（NO）供应的减少

众所周知，NO可以通过不同的化学反应修饰蛋白质，它通过与血红素基团的过渡金属离子形成复合物或配位化合物发挥作用，而依赖NO形成的环磷酸鸟苷（cGMP）是血管舒张功能的基础。然后，cGMP激活蛋白激酶G以介导NO的多种效应。有研究显示[9]在病理状态下，不同程度NO的生成会产生不同的作用结果，而在生理情况下NO通过抑制mPTP的持续开放而保护线粒体的正常功能。

研究表明[10]，RNS的硝基化作用可能会导致活性NO的供应量减少。然而在病理情况下，NO与O2-反应就足以形成ONOO-。ROS诱导白细胞粘附内皮细胞，致使“无回流现象”出现，进而导致NO缺乏及自由基减少。由于ONOO-不可逆转地阻断线粒体呼吸链。ONOO-与呼吸链复合物的巯基和铁硫簇发生反应，诱导锰依赖性过氧化物歧化酶（MnSOD）硝化/氧化，进而增强线粒体氧化应激形成恶性循环。但NO..缺乏会导致血管收缩、血栓形成等病理反应，当NO充足时.，可降低ONOO-浓度而减少其的细胞毒性[11]。

1.3 钙超载

在常氧情况下，钙离子促使线粒体内ATP的合成。局部缺血时细胞内开始摄取Ca2+，再灌注期间摄取更多。局部缺血后发生再灌注时Ca2+的转运会引起组织的过度收缩。一些被Ca2+超载激活的钙依赖蛋白酶可以部分降解收缩蛋白，从而引起收缩带坏死、心肌顿抑、心室舒张压增加[12]。Ca2+超载有利于线粒体中凋亡因子的表达和增加细胞渗透压而导致心肌细胞肿胀破裂，线粒体内的Ca2+超载致使mPTP的开放延长，这是真正导致细胞凋亡的关键。线粒体Ca2+超载会促进ROS的生成，延长mPTP的开放，导致线粒体外膜（Outer mitochondrial membranes，OMM）肿胀破裂和细胞色素c释放，进而导致细胞凋亡。

1.4 线粒体通透性转换孔开放

mPTP是一个非特异性的线粒体膜通道，由腺嘌呤核苷酸移位酶、电压依赖性阴离子通道、环孢素受体-D组成。mPTP的持续性开放使得线粒体膜通透性增加，导致大量的非选择性分子和其他物质流入线粒体而使其破裂，造成心肌细胞不可逆死亡，还会造成心衰等不良后果[13,14]。Ca2+超载、ROS、无机磷酸盐、线粒体的去极化可延长缺血再灌注状态下心肌细胞mPTP的开放[15]。缺血再灌注损伤的主要病理原因为mPTP的开放，再灌注损伤可使线粒体去极化，使线粒体基质中小分子量物质丢失等。在生理条件下，mPTP始终处于开放和关闭交替的过程中，通过这种交替的开放来调节线粒体内离子平衡，进而维持细胞正常生理功能。

2 氧化还原和心脏保护途径之间的关系

ROS/RNS与信号通路作用的三个时间点分别为缺血前预处理时、短暂缺血预处理的缺血再灌注时、缺血再灌注初期预处理和后处理时。

具有保护作用的活性物质来源广泛，比如作为级联保护机制靶点的线粒体K+-ATP通道就发挥了关键作用。有研究报道，NO通过激活心室肌细胞线粒体依赖ATP敏感钾通道（mKATP）通道，使线粒体基质碱化从而产生保护性作用[16]。然而，mKATP通道的开放也可能产生毒作用。mKATP通道除了磷酸化，还能被NO-及其衍生物和氢硫化物激活，另外，线粒体连接蛋白-43也可能参与了ROS信号通路。PKC是ROS在氧化还原信号通路中的靶点，如心脏通过预处理将自由基注入冠状动脉发挥保护作用，而PKC拮抗剂可以阻断这种保护作用。在体外研究发现[17]，ROS与硫醇基团反应和RNS亚硝基化都能激活PKC。而谷胱甘肽介导的S-亚硝基化可使毒性作用逆转为保护作用。

PKC是心脏保护级联信号中的关键分子，PKC通过去磷酸化和磷酸化传递信号，在抑制mPTP开放过程中起着重要作用[18]。再者，ROS/RNS的产生致使mKATP开放，激发与PKC相关的激酶激活并在缺血再灌注时血管紧张素II的生成中发挥着重要作用[19]。

研究发现：ROS清除剂乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）和N-(2-巯基丙酰基)甘氨酸[（N-(2-mercaptopropionyl)-glycine，MPG]在缺血后处理中发挥着保护作用[20]。依据局部缺血指数，在心肌缺血再灌注的最初几分钟里给予ROS清除剂预处理可以达到保护作用。在缺血再灌注早期，心肌细胞产生大量活化的内源性抗氧化酶，这些酶在缺血再灌注损伤后处理的保护机制中不可或缺。持续细胞内高酸浓度会触发细胞内一系列病理分子机制，这也是导致缺血再灌注损伤重要因素之一。当酸中毒阻止mPTP开放时，在缺血再灌注初期再引入O2-会促使ROS信号通路激活级联保护机制，同样还会阻止线粒体酶的复活，并产生大量的ROS。另外，缺血再灌注后处理的酸中毒还会导致非酶性NO-的形成。

缺血再灌注早期mPTP的开放受到很多因素的抑制，尤其是缺血再灌注早期的持续酸中毒，在限制mPTP开放和促进酶和/或非酶保护机制中发挥着重要的作用。在缺血再灌注预处理和后处理中，磷酸化及其他信号转导模式（O-联糖基化、S-亚硝基化）通过线粒体发挥不同程度的保护作用。

2.1 O- 联糖基化 (O-GlcNAcylation)

有研究表明，氧化还原剂与O-GlcNAcylation信号通路之间存在交互作用，这与心脏保护有很强的关联：线粒体中ROS产量的增加会伴随O-GlcNAcylation的增加，进而导致线粒体蛋白质O-联糖基化和线粒体耐受性的增加。另外，心肌细胞O-GlcNAcylation水平的增加会抑制H2O2诱导的线粒体膜电位丧失，这可能是线粒体膜蛋白如电压依赖性离子通道的O-联糖基化引起的[21]。

2.2 由活性氧/活性氮引发的氧化还原信号

在生理条件下的适当调节，ROS和RNS并不是单纯有害，他们在线粒体内外的信号通路中都发挥着重要的作用[22]。ROS/RNS诱导的细胞应答包括：调节细胞的氧化还原状态及传递给细胞器和细胞核，从而进一步调控生理/病理状态下相关功能，如应激反应、衰老、细胞程序性死亡等。

许多G蛋白偶联受体激活触发的保护作用也是通过ROS依赖的包括PKC激活在内的作用机制。研究表明：ROS在缺血后处理的保护作用中也发挥着一定作用；在缺血后处理中多种ROS清除剂如NAC和/或MPG起着阻止保护的作用[23]，但是在缺血再灌注时给予嘌呤/黄嘌呤氧化酶，产生ROS而发挥的心脏保护作用不能重现。ROS清除剂在缺血再灌注初期会取消预处理和后处理发挥的保护作用，这说明ROS清除剂在不同时间点发挥着不同作用。在大鼠常规缺血再灌注后5min实施处理会增加心脏3-硝基酪氨酸浓度，但是胆固醇喂养的大鼠却不会。因此，缺血再灌注后处理早期ONOO-的增加在后处理保护机制中发挥着一定作用。有研究[24]表明缺血再灌注后处理会减少ONOO-的形成而发挥保护作用。在兔常规缺血再灌注后处理，会减少心肌细胞3-硝基酪氨酸水平，但高脂血症兔3-硝基酪氨酸水平则无降低表现。许多不同的内源性酶如SOD、过氧化氢酶等调节组织内ROS的动态平衡。而在缺血再灌注早期的后处理会直接改变这些酶的激活，降低SOD而增加过氧化氢活性。这些作用可能会影响到RNS的形成和S-亚硝基化，从而降低损伤。

2.3 S- 亚硝基化

NO可以通过酶和非酶途径产生，在半胱氨酸巯基、氨基酸类（赖氨酸和N-末端）、S-亚硝基（S-NO复合物）存在时NO-与蛋白质的共价结合是局部缺血/缺血再灌注的重要环节，由于其强氧化性，在体内的反应影响着许多蛋白质的功能。由于NO-和巯基化学作用的复杂性，存在许多可能的反应机制导致S-亚硝基化。NO在心肌保护中的作用涉及到非cGMP依赖的和伴随经典的cGMP依赖性的氧化还原机制。NO通过环化鸟苷酸合酶致使蛋白质的S-亚硝基化，进而影响着线粒体的生理功能发挥作用，从而在心肌缺血再灌注保护机制中发挥着重要作用[25]。在心肌保护作用中S-亚硝基化增加的蛋白质大部分为线粒体蛋白。S-亚硝基化增加是缺血再灌注后处理的蛋白质，尤其是低分子蛋白质功能结构变化的主要趋势，而在缺血再灌注初期，S-亚硝基化在线粒体蛋白发生定向，从而对抗局部缺血/缺血再灌注损伤。

3 总结

心肌缺血再灌注损伤，是氧化应激反应所造成的，而细胞/线粒体Ca2+超载，活性NO的减少，细胞内pH值的恢复，以及由此形成的mPTP开放，会导致ROS/RNS大量的释放[26,27]。有效NO供应量的减少或缺乏可导致血管收缩和血栓形成等。缺血再灌注早期酸中毒是前处理和后处理中为避免mPTP开放及通过ROS信号通路的必然因素。早期缺血再灌注的保护级联反应集中于线粒体，尤其是mPTP。多种蛋白激酶磷酸化，其他方式的细胞信号转导也开始进行。新发现的信号转导机制如蛋白质的O-GlcNAc糖基化、S-亚硝基化和S-巯基化在调节细胞功能和应激反应中发挥关键作用，当这些转导机制增加时，I/R损伤减少，而当它们减少时则损伤加剧。对缺血再灌注损伤分子机制的深入研究，有助于我们进一步了解相关信号通路及交互机制的影响，以便早日将新的理论应用于缺血再灌注的预防和临床治疗。

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