张婷，郭景阳，乔敏敏，杨宇，陈琳，李春梅，吕建新

（温州医科大学 检验医学院生命科学学院，浙江 温州 325035）

2型糖尿病（T2DM）是由肝脏葡萄糖产生增加、葡萄糖利用异常及胰岛素分泌不足引起的[1]，以胰岛素抵抗和胰腺β细胞功能失调为特征的疾病[2]。糖尿病患者在世界范围内正在迅猛增加，2000年全球糖尿病患者总数为1.71亿，预计到2030年将达到3亿以上，其中T2DM约占90%[3]。2004年统计显示，我国糖尿病人数约4000万，但是根据2009年最新公布的数据显示，我国糖尿病患者已经达到9400万[4]，说明实际糖尿病发病率增长将比预计高出很多。因此，目前迫切需要安全无不良反应，能防治糖尿病尤其是T2DM的药物。

有研究显示，从荔枝中提取的小分子多酚在体内和体外均可诱导一些改变，如抗肿瘤细胞凋亡[5]、对小鼠的抗氧化和抗感染作用[6]、对运动员的抗疲劳作用[7]。越来越多的研究[8-9]显示，荔枝核提取物有调节血糖、改善糖尿病糖脂代谢紊乱和预防糖尿病并发症发生的作用。但是对于荔枝核对T2DM降糖作用的分子机制我们目前还不清楚。microRNAs（miRNAs）是一种小的内源性非编码RNA分子，这些小的miRNA通常靶向一个或者多个mRNA，可以有效地降低靶mRNA的水平，在基因表达调控中起到重要的作用，当然，miRNA本身的表达也受到严格的调控。大量研究已经证实，miRNAs与胰岛素抵抗的形成密切相关。因此，我们通过追踪检测T2DM的理想模型db/db小鼠的体质量、摄食量、饮水量、空腹血糖、糖耐量和胰岛素耐量的变化，并通过血清miRNAs芯片和Real-time PCR技术，初步研究荔枝核降低db/db小鼠血糖的可能机制。

1 材料和方法

1.1 材料 荔枝核提取物50 g，由南京中医药大学植物药研究与新药开发中心暨南京植物药深加工工程研究中心提供；血糖仪和血糖试纸；胰岛素；50%葡萄糖溶液；RNA提取试剂盒（QIAGEN）；大鼠胰岛素ELISA试剂盒购自上海西塘生物科技有限公司；逆转录试剂盒和PCR试剂盒均购自大连Takara公司；db/db小鼠由南京大学模式动物研究所提供，C57BL/6小鼠由温州医科大学实验动物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及给药方案：实验于温州医科大学实验动物中心完成。SPF级db/db小鼠8只和C57BL/6小鼠3只，雄性，鼠龄2个月左右，普通饮食，自由饮水。将小鼠分为3组：荔枝核处理组（db/db小鼠5只），未处理组（db/db小鼠3只）和正常对照组（C57BL/6小鼠3只）。分3笼饲养，编号并做好标记。荔枝核处理组用荔枝核提取物给予灌胃治疗7周后给予去离子水灌胃3周，后继续荔枝核灌胃2周，每只小鼠剂量为0.3 mL（含0.015 g荔枝核提取物溶于0.3 mL去离子水中），1次/d。未处理组和正常对照组一直给予等量去离子水灌胃。

1.2.2 体质量、摄食量、饮水量和空腹血糖检测：体质量检测：每周称量小鼠体质量。摄食量检测：灌胃3、6、9周时，每天上午9:00每笼小鼠给予50 g食物，第2天9:00称量剩余的食物，继续添加至50 g，连续5 d。饮水量检测：灌胃3、6、9周时，每天9:00每笼小鼠给予200 mL去离子水，第2天9:00量取剩余的去离子水，继续添加至200 mL，连续5 d。空腹血糖检测：小鼠禁食整晚后，尾静脉采血，检测空腹血糖。

1.2.3 糖耐量和胰岛素耐量试验：糖耐量试验：小鼠禁食整晚后，尾静脉采血测定空腹血糖；之后腹腔注射50%葡萄糖（1 g/kg 体质量），于注射后30、60、90、120 min尾静脉采血测定血糖。胰岛素耐量试验：小鼠禁食5 h后，尾静脉采血测定空腹血糖；之后腹腔注射胰岛素（1 U/kg体质量），于注射后30、60、90 min尾静脉采血测定血糖。

1.2.4 血清Exiqon miRNAs芯片分析：血清miRNAs芯片检测分析实验流程：设计实验基因芯片、制备RNA样品（将荔枝核处理组和未处理组血清分别等量混匀后，取200μL血清提取总RNA）、标记miRNA、miRNA序列杂交、Axon GenePix 4000B芯片扫描仪扫描芯片，获取扫描图片后进行数据分析。芯片的具体实验步骤，委托上海康成生物工程有限公司完成。

1.2.5 Sfmbt2表达水平：水合氯醛麻醉小鼠后，迅速分离肝脏和肌肉组织，用1% PBS清洗后保存在-80℃。提取肝脏和肌肉组织中总RNA，去除基因组DNA后逆转录成cDNA，通过Real-time PCR技术分析Sfmbt2表达水平的改变。用2-ΔΔCt来确定每个基因改变的倍数，其中ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct管家基因）实验组-（Ct目的基因-Ct管家基因）对照组。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.3 统计学处理方法 使用SPSS 17.0软件进行统计分析。所有数据均用±s表示，两组数据之间差异比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 荔枝核提取物对db/db小鼠和C57BL/6小鼠体质量、摄食量和饮水量的影响 荔枝核灌胃治疗后，荔枝核处理组体质量与未处理组db/db小鼠差异无统计学意义（P＞0.05）；摄食量与未处理组小鼠相比无明显改变（P＞0.05）；荔枝核处理组在灌胃6周时与未处理组相比，饮水量明显减少（P＜0.05）。各组小鼠体质量、摄食量、饮水量见图1。

图1 各组小鼠体质量、摄食量、饮水量结果

2.2 荔枝核提取物对db/db小鼠和C57BL/6小鼠空腹血糖的影响 荔枝核灌胃治疗后，db/db小鼠荔枝核处理组与未处理组相比，空腹血糖明显下降（P＜0.05），与正常对照组比血糖差异无统计学意义（P＞0.05）。并且在灌胃8～10周时荔枝核处理组db/db小鼠给予去离子水灌胃，其空腹血糖比未处理组也明显下降（P＜0.05）。db/db小鼠荔枝核处理组血糖维持在相对较低水平，未处理组血糖维持在较高水平，正常对照组C57BL/6小鼠血糖维持在正常水平。各组小鼠空腹血糖见图2。

图2 各组小鼠空腹血糖结果

2.3 荔枝核提取物对db/db小鼠和C57BL/6小鼠糖耐量和胰岛素耐量的影响 结果显示，荔枝核处理组db/db小鼠糖耐量受损无明显改善（P＞0.05），正常对照组C57BL/6小鼠糖耐量在正常水平。各组小鼠糖耐量结果见图3。

图3 各组小鼠糖耐量结果

与糖耐量结果相一致，荔枝核处理组db/db小鼠与未处理组相比，胰岛素耐量受损无明显改善（P＞0.05），正常对照组C57BL/6小鼠胰岛素耐量在正常水平。各组小鼠胰岛素耐量结果见图4。

2.4 db/db小鼠血清miRNAs基因结果分析 荔枝核灌胃治疗后，血清miRNAs芯片结果显示，db/db小鼠荔枝核处理组与未处理组相比，有120个miRNAs表达水平出现明显改变，其中上调的基因有71个，下调的基因有49个。见图5，下调的基因中mmumiR-297a-3p、mmu-miR-669f-5p、mmu-miR-467d-3p、mmu-miR-466c-5p均来源于Sfmbt2的第10内含子，见图6。

图4 各组小鼠胰岛素耐量结果

图5 各组小鼠血清miRNAs所示差异表达的miRNAs聚类图

图6 Sfmbt2内含子所包含的miRNAs

2.5 荔枝核提取物对db/db小鼠Sfmbt2表达水平的影响 通过Real-time PCR发现db/db小鼠荔枝核处理组肝脏组织中Sfmbt2表达水平降低，下降为未处理组的64.4%；肌肉组织中Sfmbt2表达水平与未处理组相比无明显差异。见图7。

图7 db/db小鼠Sfmbt2表达水平

3 讨论

糖尿病是威胁人类健康的主要疾病之一，病死率仅次于肿瘤和心血管疾病；且其在发达和发展中国家均以指数形式增加，年轻化趋势明显[10]。荔枝核提取物有调节血糖、改善糖尿病糖脂代谢紊乱和预防糖尿病并发症发生的作用。db/db小鼠是一种由leptin基因受体缺陷引起的先天肥胖性T2DM模型[11]。db/db小鼠存在明显的糖代谢异常，其糖尿病的表现和病程与人类T2DM极为相似，是研究T2DM的理想模型[12]。因此我们通过给予db/db小鼠荔枝核灌胃治疗，初步分析荔枝核提取物降低db/db小鼠血糖的可能机制。

我们的研究结果显示，荔枝核处理组db/db小鼠体质量、摄食量无明显改变，饮水量在灌胃6周时明显减少，说明荔枝核提取物灌胃治疗可以改善db/db小鼠的饮水情况，但是对体质量和摄食量并无明显改善，考虑可能是灌胃的时间不够或灌胃剂量不够。

荔枝核灌胃治疗后，db/db小鼠荔枝核处理组空腹血糖水平明显下降，而未处理组血糖一直处于较高水平；正常对照组C57BL/6小鼠前后血糖无明显变化。说明荔枝核有一定的降糖效果，可明显降低db/db小鼠的空腹血糖，与之前研究中显示的荔枝核的降糖作用一致[8-9]。并且在灌胃8～10周时荔枝核处理组db/db小鼠给予去离子水灌胃，其空腹血糖比未处理组也明显下降，说明荔枝核灌胃治疗一段时间后，即使不再给予荔枝核，其血糖也可以维持在相对较低水平。

然而，荔枝核处理组db/db小鼠糖耐量和胰岛素耐量受损情况并未出现明显改善，我们猜测可能是因为模型小鼠胰岛素抵抗比较严重，短期内不易改善。

miRNAs是一类新发现的内源性基因表达调节分子，研究显示，它与胰腺中胰岛素分泌功能[13]、脂代谢[14-15]、糖尿病并发症如糖尿病心脏病[16-17]、糖尿病肾病[18]及其他多种疾病均密切相关，因此近年来miRNAs被考虑作为诊断疾病或监测病情进展的分子标志物。我们从血清miRNAs芯片表达谱中发现，db/db小鼠荔枝核处理组血清中miRNAs表达差异明显，其中上调的基因有71个，下调的基因有49个，并且下调的基因中mmu-miR-297a-3p、mmu-miR-669f-5p、mmu-miR-467d-3p、mmu-miR-466c-5p均来源于Sfmbt2的第10内含子。之后我们通过Real-time PCR检测结果发现，肝脏组织中Sfmbt2表达水平降低，肌肉组织中Sfmbt2表达水平无明显差异，考虑血糖改变主要与肝脏代谢有关。db/db小鼠荔枝核灌胃治疗后，其机制改变可能与Sfmbt2参与的机制有关，Sfmbt2基因是Polycomb group中的印记基因，它的早期胚胎遗传父亲的等位基因，晚期遗传胚胎外组织[19-20]，然而对于荔枝核提取物降低db/db小鼠血糖的具体机制目前还不清楚，还需要进一步研究。

总之，本研究发现荔枝核可以明显降低db/db小鼠的空腹血糖水平；并且，荔枝核灌胃治疗后miRNAs及mRNA水平也发生改变。我们推测，荔枝核提取物对db/db小鼠的降糖作用可能与miRNAs及Sfmbt2表达变化有关，相关的机制还需要进一步研究。荔枝核是否可以作为一种新的口服降糖药广泛应用于T2DM患者，还有待于进一步的临床验证。

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