陶 冶，张小卿，吴 琼，吴景东

（1.辽宁中医药大学基础医学院中医基础教研室，辽宁 沈阳110847；2.辽宁中医药大学针灸推拿学院针灸教研室，辽宁 沈阳110847；3.中国医科大学附属盛京医院小儿神经内科，辽宁 沈阳110004；4.辽宁中医药大学学生工作处，辽宁 沈阳110847）

绞股蓝总皂苷对光老化HaCaT细胞中p38MAPK蛋白和c－Jun mRNA表达的抑制作用

陶 冶1，张小卿2，吴 琼3，吴景东4

（1.辽宁中医药大学基础医学院中医基础教研室，辽宁 沈阳110847；2.辽宁中医药大学针灸推拿学院针灸教研室，辽宁 沈阳110847；3.中国医科大学附属盛京医院小儿神经内科，辽宁 沈阳110004；4.辽宁中医药大学学生工作处，辽宁 沈阳110847）

目的：观察绞股蓝总皂苷含药血清对光老化HaCaT细胞p38促分裂原活化蛋白激酶 （p38MAPK）蛋白和Jun基因 （c－Jun）mRNA表达的影响，探讨绞股蓝总皂苷含药血清抗皮肤光老化的作用机制。方法：采用中波紫外线 （UVB）照射建立光老化HaCaT细胞模型，加低、中、高剂量绞股蓝总皂苷含药血清于光老化HaCaT细胞模型培养液中培养，并设空白对照组、空白血清组和UVB模型组。采用Western blotting和RTPCR方法检测各组细胞p38MAPK蛋白和c－Jun mRNA的表达水平。结果：与空白对照组比较，UVB模型组细胞p38MAPK蛋白和c－Jun mRNA表达显著上调，差异有统计学意义 （P＜0.01）；与UVB模型组比较，低、中和高剂量含药血清组细胞p38MAPK蛋白和c－Jun mRNA表达显著下调，差异有统计学意义 （P＜0.01）；与空白血清组比较，低、中和高剂量含药血清组细胞p38MAPK蛋白和c－Jun mRNA表达下降 （P＜0.01）。结论：绞股蓝总皂苷含药血清可能通过抑制p38MAPK蛋白和c－Jun mRNA表达抑制皮肤光老化。

光老化；绞股蓝总皂苷；角质形成细胞；中波紫外线；p38促分裂原活化蛋白激酶；Jun基因

反复的日光照射会导致皮肤光老化，引发皮肤干燥、色素增加、松弛和皱纹形成等皮肤改变，甚至会引发皮肤良性和恶性肿瘤。皮肤光老化的分子机制主要为胶原蛋白降解增加和合成减少，应用中药提取物抑制皮肤光老化是近些年来研究的热点［1－2］。角质细胞是光老化过程中涉及的主要细胞类型之一。有关绞股蓝总皂苷抗皮肤光老化的作用机制目前国内外尚无相关报道。本研究应用绞股蓝总皂苷含药血清体外干预中波紫外线 （UVB）照射的具有与人皮肤角质细胞分化特性高度相似的人永生化皮肤角质形成细胞株 （HaCaT）细胞，探讨绞股蓝总皂苷抑制皮肤光老化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物、细胞、试剂及仪器 20只雄性SD大鼠 （SPF级）购自中国医科大学，体质量200～250g，合格证号SCXK （辽）2008－0005；HaCaT细胞 （上海艾研生物科技有限公司）；绞股蓝总皂苷 （MUST－11031401，成都曼斯特生物科技有限公司），兔抗人p38促分裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）抗体 （bs－0637R，购自北京博奥森生物科技有限公司），RT－PCR 试剂盒（DRR014A，购自大连宝生物工程有限公司）；电热恒温培养箱 （HH·B11·500型，上海跃进医疗器械厂），凝胶成像分析系统 （Chemi Imager 5500型，美国Alphainnotech chemi Imager公司），垂直板电泳装置 （Mini－ProteinⅢ型，美国BIORAD公司），UVB光源 （20W，南京华强电子有限公司）。

1.2 动物分组及给药 20只大鼠随机分为正常对照组、绞股蓝低剂量组、绞股蓝中剂量组和绞股蓝高剂量组，每组5只。成人绞股蓝服药量约为30g·d－1，绞股蓝总皂苷提取体积分数为3%，根据Meeh－Rubner公式换算，200g体质量大鼠每天给药量约为0.016g，即绞股蓝低剂量组大鼠给药剂量约为80mg·kg－1·d－1；绞股蓝中剂量组约为160mg·kg－1·d－1；绞股蓝高剂量组约为320mg·kg－1·d－1。正常对照组大鼠不予灌胃。取绞股蓝总皂苷充分溶于生理盐水后给大鼠灌胃，每日灌胃1次，共灌胃7d，第7天正常灌胃1h后，经大鼠腹主动脉取血，置于促凝管内，室温静置1h，2 000r·min－1离心10min，收集上清，56℃水浴灭活30min，0.22μm滤膜过滤，置于5mL离心管，冻存备用。

1.3 光老化HaCaT细胞模型的建立 HaCaT细胞于37℃、5%CO2，10%胎牛血清 （FBS）、双抗的DMEM高糖培养基条件下正常培养。参照文献［3－4］及预实验结果，取对数生长期的细胞消化成单细胞悬液，以细胞密度1×104mL－1接种于一新培养瓶，每瓶5mL，共接种60瓶，培养24h。随机抽取其中10瓶细胞，设为空白对照组，不进行UVB照射和绞股蓝总皂苷含药血清干预，正常培养。其余50瓶细胞，随机分为UVB模型组、空白血清组、低剂量含药血清组、中剂量含药血清组和高剂量含药血清组，每组10瓶，分别弃去培养液，加入适量PBS反复洗至无色后加入2mL PBS，放在UVB灯下照射，根据公式 （UVB剂量＝UVB辐照强度×时间）计算照射剂量为35mJ·cm－2，灯源和培养瓶间距15cm。UVB模型组细胞经照射后，弃去PBS，加入5mL新鲜培养液，正常培养；空白血清组细胞经照射后，弃去PBS，加入5mL含10%正常对照组大鼠血清的新鲜培养液，正常培养；低、中、高剂量含药血清组细胞照射后，弃去PBS，分别加入5mL含10%低、中和高剂量组大鼠血清的新鲜培养液，正常培养；12h后，检测6组细胞p38MAPK蛋白表达量和c－Jun mRNA表达量。

1.4 Western blotting法检测各组细胞p38MAPK蛋白表达量 以上6组细胞，每组随机抽取5瓶，采用Western blotting法对细胞中p38MAPK蛋白的表达水平进行检测。收集细胞，应用Western blotting及IP细胞裂解缓冲液于冰上提取总蛋白，BCA法测定各组蛋白含量，调整含量为2 000mg·L－1，40μg蛋白上样，电泳，将蛋白转至PVDF膜。5%脱脂奶粉室温封闭1h，一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育1h。暗室内ECL发光，X光胶片曝光，采集照片，分析结果，以目的条带积分光密度值／内参条带积分光密度值的比值表示p38mAPK蛋白表达量。

1.5 RT－PCR法检测各组细胞中c－Jun mRNA 表达水平 采用RT－PCR法对各组剩余的5瓶细胞中c－Jun mRNA的表达水平进行检测。内参GAPDH的上游引物序列为5′－GTC AGT GGT GGA CCT GAC CT－3′，下游引物序列为5′－AGG GGT CTA CAT GGC AAC TG－3′，扩增片段长度为420bp；目的基因c－Jun上游引物序列为5′－AGA ATC CGA AGG GAA AGG AA－3′，下游引物序列为5′－CTT CTC CTT CAG CAG GTT GG－3′，扩增片段长度为221bp。收集细胞，应用Trizol提取细胞中总RNA，然后将mRNA逆转录为cDNA，再利用引物对其进行扩增，扩增后的产物于1.5%的琼脂糖凝胶中电泳，电泳结束后在凝胶成像分析系统中进行观察，并采集照片，对各条带的积分光密度值进行测定，最后以每个样本的目的条带与内参条带的积分光密度值之比表示c－Jun mRNA表达水平。

1.6 统计学分析 采用SPSS 10.0软件包对各组数据进行分析。p38MAPK蛋白和c－Jun mRNA表达量以±s表示，组间比较采用单因素方差分析。

2 结 果

各组细胞p38MAPK蛋白和c－Jun mRNA表达量：空白对照组细胞p38MAPK蛋白和c－Jun mRNA表达处于低水平；与空白对照组比较，UVB模型组细胞p38MAPK蛋白和c－Jun mRNA表达显著上调，差异有统计学意义 （P＜0.01）；与UVB模型组比较，低、中和高剂量含药血清组细胞p38MAPK蛋白和c－Jun mRNA表达显著下调，差异有统计学意义 （P＜0.01）；与空白血清组比较，低、中和高剂量含药血清组细胞p38MAPK蛋白和c－Jun mRNA表达显著下调，差异有统计学意义 （P＜0.01）；随着绞股蓝总皂苷含药血清含量的增加，低、中和高剂量含药血清组细胞p38MAPK蛋白和c－Jun mRNA表达逐渐下调，各组间差异均有统计学意义 （均P＜0.05）。见表1、图1和2。

表1 各组细胞中p38MAPK蛋白和c－Jun mRNA表达水平Tab.1 Eexpressions levels of p38MAPK protein and c－Jun mRNA of cells in various groups （n＝5，±s）

表1 各组细胞中p38MAPK蛋白和c－Jun mRNA表达水平Tab.1 Eexpressions levels of p38MAPK protein and c－Jun mRNA of cells in various groups （n＝5，±s）

＊ P＜0.01 vs blank control group；△P＜0.01 vs UVB model group；＃P＜0.01 vs blank serum group.

Group Expression of p38MAPK protein Expression of c－Jun mRNA Blank control 0.279±0.016 0.257±0.029 UVB model 0.832±0.062＊ 0.813±0.044＊Blank serum 0.799±0.056＊ 0.732±0.039＊Low dose of gypenosides－containing serum 0.550±0.031＊△＃ 0.620±0.023＊△＃Middle dose of gypenosides－containing serum 0.440±0.022＊△＃ 0.555±0.035＊△＃High dose of gypenosides－containing serum 0.378±0.022＊△＃ 0.500±0.022＊△＃

图1 各组细胞中p38MAPK蛋白表达电泳图Fig.1 Electrophoregram of expressions of p38MAPK protein of cells in various groupsLane 1：Blank control group；Lane 2：UVB model group；Lane 3：Blank serum group；Lane 4－6：Low，middle，and high doses of gypenosides－containing serum groups.

图2 各组细胞中c－Jun mRNA表达电泳图Fig.2 Electrophoregram of expression of c－Jun mRNA of cells in various groupsM：Marker；Lane 1：Blank control group；Lane 2：UVB model group；Lane 3：Blank serum group；Lane 4－6：Low，middle，and high doses of gypenosides－containing serum groups.

3 讨 论

绞股蓝为葫芦科植物绞股蓝的全草，具有清热解毒、益气养阴及生津安神的功效。体内实验研究［5］表明：绞股蓝提取液可以延缓皮肤光老化动物的皮肤衰老。现代研究［6］表明：绞股蓝除含有糖类、黄酮、氨基酸、甾醇和维生素C等微量元素外，主要成分为绞股蓝总皂苷，具有抗衰老、抗疲劳和抗缺氧等广泛功效。研究［7］表明：紫外线照射皮肤光老化分子机制为紫外线辐射皮肤表皮角质形成细胞和真皮成纤维细胞，角质细胞是UVB辐射的主要目标，表皮生长因子受体和有关细胞因子受体通过一系列上游激酶的活化激活丝裂原活化蛋白激酶 （MAPK），上调c－Jun的表达，增高的c－Jun和组成型表达的c－Fos结合成转录因子活化蛋白－1（AP－1），刺激基质金属蛋白酶 （MMPs）的基因转录，进一步特异性降解几乎所有的细胞外基质。p38MAPK属于MAPK家族 （细胞外信号调节激酶ERK，c－Jun N端激酶JNK和p38MAPK）成员，主要被紫外线辐射所激活［8－9］。p38MAPK 通路被激活后，可以激活其下游信号分子NF－κB和AP－1 （c－Jun，c－Fos），刺激 MMPs的转录［10］。本研究针对MAPK信号转导过程中的关键蛋白p38MAPK和基因c－Jun mRNA表达水平进行研究，结果表明：经UVB照射后的HaCaT细胞内p38MAPK蛋白和c－Jun mRNA表达水平显著上升。本文作者认为：UVB可能是通过激活HaCaT细胞内的MAPK信号转导通路而实现其对细胞的光损伤作用，这一结果与以往研究［3，11］基本一致。有研究［3］表明：UVB诱导的HaCaT细胞中，石榴提取物 （POMx）能抑制UVB MAPK表达的上调和c－Jun的磷酸化从而防止皮肤光老化；杨梅黄酮可以抑制UVB辐射诱发的p38MAPK上调抑制皮肤光老化；山柰酚可以抑制p38MAPK蛋白和JNK表达，保护皮肤光老化。

另外，本研究采用不同剂量的绞股蓝总皂苷对大鼠进行灌胃，连续7次，然后采集末次给药后1h的大鼠含药血清用于实验。绞股蓝总皂苷的原有成分进入机体所产生的药理作用机制十分复杂，研究［11］表明：其在体内可能会转化为活性成分，或者代谢后失去活性，或者其本身并无作用但经代谢后而产生作用，或者通过第二信使间接起作用。因此本研究方法更接近药物在体内产生药理效应的真实过程，理论上更具科学性和真实性。

含药血清干预结果表明：与UVB模型组比较，绞股蓝总皂苷含药血清各组p38MAPK蛋白和c－Jun mRNA的表达量降低，随着绞股蓝总皂苷含药血清含量的增高，其下调作用明显加强，成剂量－效应依赖；空白血清组的p38MAPK蛋白和c－Jun mRNA表达水平尽管有所下调，但差异无统计学意义。本研究提示：空白大鼠血清对光老化模型HaCaT细胞的作用可能来自于血清对细胞的营养作用，但作用甚微；而不同剂量绞股蓝总皂苷含药血清对光老化模型HaCaT细胞内p38MAPK蛋白和c－Jun mRNA的表达水平呈现明显的抑制作用，并呈量－效依赖，由此提示：绞股蓝总皂苷在体内经过代谢可产生明显的抑制p38MAPK蛋白和c－Jun mRNA表达的作用，该作用可能是绞股蓝总皂苷能够抵抗紫外线损伤作用的关键机制之一。但绞股蓝总皂苷对于MAPK家族其他信号分子的作用影响尚未作详细研究，有待进一步探讨。

综上所述，绞股蓝总皂苷含药血清可以抑制UVB照射HaCaT细胞诱导的p38MAPK蛋白和c－Jun mRNA表达水平增高，并成良好的剂量－效应关系。绞股蓝总皂苷含药血清可能通过抑制p38MAPK蛋白和c－Jun mRNA表达抑制皮肤光老化。

［1］Lee YR，Noh EM，Jeong EY，et al.Cordycepin inhibits UVB－induced matrix metalloproteinase expression by suppressing the NF－kappaB pathway in human dermal fibroblasts［J］.Exp Mol Med，2009，41 （8）：548－554.

［2］Li YH，Wu Y，Wei HC，et al.Protective effects of green tea extracts on photoaging and photoimmunosuppression ［J］.Skin Res Technol，2009，15 （3）：338－345.

［3］Zaid MA，Afaq F，Syed DN，et al.Inhibition of UVB－mediated oxidative stress and markers of photoaging in immortalized HaCaT keratinocytes by pomegranate polyphenol extract POMx ［J］.Photochem Photobiol，2007，83 （4）：882－888.

［4］林秉奖，闵 玮，骆 丹，等.中波紫外线对HaCaT细胞凋亡、细胞周期变化及p16、c－myc蛋白表达的影响及阿魏酸干预作用研究 ［J］.中国中西医结合皮肤性病学杂志，2010，9 （1）：8－11.

［5］吴景东.绞股蓝抗皮肤光老化的实验研究 ［D］.沈阳：辽宁中医药大学，2006.

［6］邱德文，杜 江.中华本草苗药卷 ［M］.贵阳：贵州科技出版社，2005，400－443.

［7］Fagot D，Asselineau D，Bernerd F.Direct role of human dermal fibroblasts and indirect participation of epidermal keratinocytes in MMP－1production after UV－B irradiation ［J］.Arch Dermatol Res，2002，293 （11）：576－583.

［8］Akasaka E，Takekoshi S， Horikoshi Y，et al.Protein oxidative damage and heme oxygenase in sunlight－exposed human skin：roles of MAPK responses to oxidative stress ［J］.Tokai J Exp Clin Med，2010，35 （4）：152－164.

［9］Sharma SD，Meeran SM，Katiyar SK.Dietary grape seed proanthocyanidins inhibit UVB－induced oxidative stress and activation of mitogen－activated protein kinases and nuclear factor－kappaB signaling in in vivo SKH－1hairless mice ［J］.Mol Cancer Ther，2007，6 （3）：995－1005.

［10］Hwang KA，Yi BR，Choi KC.Molecular mechanisms and in vivo mouse models of skin aging associated with dermal matrix alterations［J］.Lab Anim Res，2011，27（1）：1－8.

［11］Jung SK，Lee KW，Kim HY，et al.Myricetin suppresses UVB－induced wrinkle formation and MMP－9expression by inhibiting Raf ［J］.Biochem Pharmacol，2010，79 （10）：1455－1461.

［12］刘鲁华.绞股蓝皂苷含药血清对谷氨酸氧化性神经损伤的保护作用 ［D］.济南：山东大学，2008.

Inhibitory effect of gypenosides on expressions of p38MAPK protein and c－Jun mRNA in photoaging HaCaT cells

TAO Ye1，ZHANG Xiao－qing2，WU Qiong3，WU Jing－dong4
（1.Department of Basic Theory of Traditional Chinese Medicine，School of Basic Medical Sciences，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847，China；2.Department of Acupuncture，School of Acupuncture and Massage，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847，China；3.Department of Pediatrics Neurology，Affiliated Shengjing Hospital，China Medical University，Shengang 110004，China；4.Student Affair Office，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847，China）

ObjectiveTo observe the effect of gypenosides－containing serum on the expressions of p38mitogenactivated protein kinase （p38MAPK）protein and c－Jun mRNA in photoaging HaCaT cells and to explore the mechanism of inhibitory effect of gypenosides－containing serum on photoaging.MethodsThe photoaging HaCaT cell model was established by UVB radiation，low，middle，and high doses of gypenosides－containing serum were used in the culture fluid of phatoaging HaCaT cell models；meanwhile blank control group，blank serum group and UVB model group were set up.The expression levels of p38MAPK protein and c－Jun mRNA of cells in each group were measured by Western blotting and RT－PCR methods.ResultsCompared with blank control group，the expression levels of p38MAPK protein and c－Jun mRNA of the cells in UVB model group were significantly increased，the difference had statistical significance（P＜0.01）.Compared with UVB model group，the expression levels of p38MAPK protein and c－Jun mRNA of cells in low，middle and high doses of gypenosides－containing serum groups were significantly decreased，the difference had statistical significance （P＜0.01）.Compared with blank serum group，the expression levels of p38MAPK protein and c－Jun mRNA of the cells in low，middle and high doses of gypensides－containing serum groups were decreased （P＜0.01）.ConclusionGypenosides－containing serum could prevent the skin photoaging by inhibinting the expressions of p38MAPK protein and c－Jun mRNA.

photoaing；gypenosides；HaCaT；ultraviolet B；p38MAPK；c－Jun

R758.14

A

1671－587Ⅹ（2012）06－1147－05

2012－06－04

辽宁省科技厅自然科学基金资助课题 （20102149）

陶 冶 （1984－），女，辽宁省丹东市人，在读医学博士，主要从事中医美容学方面的研究。

吴景东 （Tel：024－31207258，E－mail：lnzywjd0719＠163.com）