何礼，韩瑞伟，唐晓飞，张志国，杨镓铭，阎雪莹#（.黑龙江中医药大学药学院，哈尔滨50040；.哈尔滨市香坊区疾病预防控制中心，哈尔滨 500；.大庆师范学院生命科学学院，黑龙江大庆 67）

染料木素（Genstein，GEN）是从豆科植物槐角Sophora japonica L.中提取得到的一种异黄酮类化合物。已有研究[1]证实GEN具有雌激素作用、抗氧化作用以及抑制拓朴异构酶活性、抑制蛋白酪氨酸激酶活性、诱发细胞程序性死亡、抑制血管生成等作用，目前1类新药“染料木素胶囊”已进入Ⅱ期临床研究，是一种很有潜力的癌症化学预防药和治疗药。然而GEN在水中溶解度为8.7 μg·mL－1[2]，是一种溶解度极低的化合物，直接口服生物利用度低，限制了其临床应用。为了提高GEN的生物利用度，本课题组采用具有良好生物相容性和应用安全性的单甲氧醚聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸共聚物（MePEGPLGA）为载体制备了GEN共聚物胶束并制成注射用GEN胶束。为预测注射用GEN胶束的体内释药行为及了解其机制，为其体内试验设计提供理论依据，本试验对其体外释放动力学进行了研究。

1 仪器与材料

LC-2010 AHT高效液相色谱（HPLC）仪（日本Shimadzu公司）；BT25 S电子天平（德国Sartorius公司）。

GEN标准品（中国食品药品检定研究院，批号：111704-200501，纯度：≥98%）；GEN原料药（西安小草植物科技有限责任公司，批号：XC100310，纯度：98.19%）；注射用GEN胶束（黑龙江中医药大学制药工程实验室，批号：20110717，规格：每瓶5 mL，含GEN 2.0 mg）；甲醇为色谱纯，水为去离子水，其余试剂均为分析纯。

透析袋（美国Sigma公司，分子量：8000～14400）。

2 方法与结果

2.1 释药介质中GEN的测定方法

2.1.1 色谱条件。色谱柱：Diamonsil C18（250mm×4.6mm，5 μm）；检测波长：260 nm；流动相：甲醇-水（60∶40），流速：1 mL·min－1；进样量：10 μL；柱温：35℃。在此色谱条件下，按GEN峰计算理论板数应不低于4000。

2.1.2 溶液的制备。标准品溶液：精密称取GEN标准品8.8 mg，置于50 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，作为标准品贮备液。

供试品溶液：取注射用GEN胶束，加适量注射用水分散，作为GEN胶束供试品溶液。

2.1.3 标准曲线和线性范围。分别精密吸取GEN标准品贮备液0.1、0.3、0.5、1、2、3 mL置于10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得浓度为1.76、5.28、8.80、17.6、35.2、52.8 μg·mL－1的一系列溶液，进样检测，以GEN峰面积（A）对其浓度（c）进行线性回归，所得标准曲线方程为：A＝124316 c－38008（r＝0.9999），表明GEN检测浓度线性范围为1.76～52.8 μg·mL－1。

2.1.4 精密度试验。取“2.1.3”项下浓度为1.76、8.80、52.8 μg·mL－1的GEN标准品溶液，进样检测，考察日内精密度，连续测定5 d，考察日间精密度。结果，低、中、高3种浓度的日内、日间RSD均小于1%，表明方法精密度良好。

2.1.5 回收率试验。取供试品溶液15份，分成3组，精密加入不同体积的GEN标准品贮备液，并用甲醇定容，使最终浓度为1.76、8.80、52.8μg·mL－1，进样检测，计算回收率。结果，低、中、高3种浓度的平均回收率均在99%以上，满足分析要求。

2.2 释放介质的选择

常用的释放介质为生理盐水和磷酸盐缓冲液（PBS）。本制剂为注射剂，考虑到人体组织环境的pH为7左右[3]，为了尽可能接近体内条件，本试验选择pH7.4的PBS溶液。但GEN在水中几乎不溶，为了满足漏槽条件，因此考虑加入适量表面活性剂或有机溶剂[4]。经考察GEN在PBS溶液与含1%吐温80、含2%吐温80、含1%十二烷基硫酸钠、含2%十二烷基硫酸钠、含10%异丙醇（V/V）、含20%异丙醇（V/V）、含30%异丙醇（V/V）、含10%乙醇（V/V）、含20%乙醇（V/V）的PBS溶液中的溶解度，结果含2%吐温80的PBS溶液（pH7.4）增溶效果最好，故选其为释放介质。释放介质、GEN标准品及样品（第10 h取的透析外液）的色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms

从图1可以看出，在上述色谱条件下，释放介质对主成分的测定无干扰，方法专一性良好，GEN峰形较好，保留时间为9.5 min。

2.3 注射用GEN胶束体外释药方法与结果

取注射用GEN胶束6瓶，每瓶精密加入4 mL注射用水分散后，转入已处理后的透析袋中，将袋口扎紧，混悬在6个盛有86 mL释放介质的小杯中，将杯放到恒温水浴振荡器37℃水浴中恒速（100r·min－1）振摇 。在释放开始后，分别于0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、36、48 h量取1 mL释放液（同时补加等量同温释放介质），经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液进样测定，计算药物的累积释药率Q（%）。精密吸取一定量GEN（原料药）溶液（GEN以释放介质为溶剂，含量与注射用GEN胶束相当），置于透析袋内，同法试验。取样时间为5、10、20、30、45、60、90、120 min，计算Q（%），结果分别见表1、表2；体外释放曲线见图2。

表1 不同取样时间点注射用GEN胶束的Q值（n＝6）Tab 1 Accumulative drug release rate Q of GEN micelle for injection at different sampling time points（n＝6）

表2 不同取样时间点GEN溶液的Q值（n＝6）Tab 2 Accumulative drug release rate Q of GEN solutions at different sampling time points（n＝6）

图2 2种样品体外释药曲线Fig 2 Drug release curves of 2kinds of samples

由表1、表2和图2可见，GEN原料药释放较快，2 h基本释放完全；而注射用GEN胶束前期释药较快，后期释放较慢，并可持续释药48 h以上，相比GEN原料药具有明显的缓释效应。

2.4 释药方程拟合

分别采用Monoexponential方程、Higuchi方程、Niebergull平方根定律、Hixcon-crowell立方根定律、Ritger-peppas方程、Weibull方程对注射用GEN胶束和GEN原料药各时间点的Q值数据进行拟合，求出其回归方程[5]。拟优合度以R2、AIC值进行综合判断，结果分别见表3、表4。

表3 注射用GEN胶束的体外释药拟合方程Tab 3 Drug release fitted equation of GEN for injection in vitro

从表3可知，除Niebergull方程外，其他各拟合方程的R2均大于自由度v＝11－2＝9、α＝0.01时的相关系数临界值0.735，表明这些方程均显著相关（P＜0.01），都可用其来描述注射用GEN胶束的体外释药规律，但以Weibull模型的拟合效果最好。从表4可知，除Hixcon-crowell方程外，其他各方程的R2均大于自由度v＝8－2＝6、α＝0.01时的相关系数临界值0.834，从方程拟合效果看，GEN原料药的体外释药最符合Monoexponential方程，即一级动力学模型。

表4 GEN原料药的体外释药拟合方程Tab 4 Drug release fitted equation of raw GEN in vitro

3 讨论

本试验采用动态透析技术考察GEN胶束在体外介质中的释放情况，整个释放过程均在透析袋中进行，因此透析袋对GEN的透膜过程是否为GEN胶束释放的限速步骤是必须考察的因素。试验表明，GEN原料药2 h的Q值大于90%，说明透析袋对GEN的释放没有阻滞作用。本试验曾以相同试验方法考察了空白胶束与GEN-载体物理混合物的体外释药情况，结果显示6 h时Q值已大于90%，说明胶束不会堵塞透析袋小孔而影响药物的释放。

由于GEN几乎不溶于水，故使其满足漏槽条件是体外释药考察时首先考虑的因素。本试验以含2%吐温80的PBS溶液（pH7.4）为释放介质。当然，这种介质不能完全代表体内的实际释放情况，体内由于酶的存在及复杂的机体作用，可能会加快GEN从胶束中的释放。

通过体外释放动力学研究表明，注射用GEN胶束的体外释药规律以Weibull模型拟合最佳，证实了其具有一定的缓释特性，从而为其进一步的体内研究提供了理论依据。

[1]Rapoport N.Physical stimuli-responsive polymeric micelles for anti-cancer drug delivery[J].Prog Polym Sci，2007，32（8-9）：962.

[2]阮丽萍，余伯阳，朱丹妮，等.染料木素的小肠吸收与体内活性相关性的研究[J].中草药，2006，4（4）：278.

[3]符旭东，高永良.缓释微球的释放度试验及体内外相关性研究进展[J].中国新药杂志，2003，12（8）：608.

[4]付 艳.银杏内酯PELGE纳米粒的研究[D].成都：四川大学，2007：53-56.

[5]黄 义，李 媛，李新中，等.齐墩果酸纳米囊体外释放研究[J].中药材，2008，31（2）：283.