徐 超 王鸿飞 邵兴锋 俞雯雯

香榧子油抗氧化活性及降血脂功能研究

徐 超 王鸿飞 邵兴锋 俞雯雯

(宁波大学生命科学与生物工程学院，宁波 315211)

通过测定香榧子油总抗氧化能力、清除O2·－、HO·和DPPH自由基能力评价其抗氧化活性;进行了香榧子油对小鼠血清中TG、TC、HDL－C和LDL－C影响的试验，考察其降血脂功能。结果表明，香榧子油能有效地清除自由基，对O2·－、HO·和DPPH自由基的IC50分别为3．16、4．20和9．20 mg/mL;与高脂模型组相比，香榧子油剂量组TG、TC和LDL－C水平显著降低(P＜0．01或P＜0．05)，HDL－C水平显著升高(P＜0．05)。香榧子油具有一定的抗氧化能力，对改善血脂水平有显著的作用。

香榧子油 抗氧化 自由基 降血脂

香榧(Torreya grandis cv．merrillii)又称榧子、真榧、玉山果、细榧等，为红豆杉科榧属常绿乔木，是我国特有的珍稀树种，主要分布在我国浙江、江苏、安徽、福建等省份的丘陵地区，其中浙江省诸暨市的香榧年产量占全国一半以上［1－2］。其果实俗称香榧子，是世界珍贵稀有干果之一，炒熟后香酥甘醇，品质甚佳，营养丰富;还具有很高的药用价值，《本草从新》认为香榧“治肺火，健脾士，补气化痰，止咳嗽，定咳喘，去瘀生新”［3］。

目前，对香榧子油的研究主要集中在测定营养成分、脂肪酸含量及组成上，在特性及功能性评价等方面的报道相对较少。本试验对超临界CO2萃取的香榧子油进行了体外抗氧化活性研究，同时在建立小鼠高脂血症模型的基础上，以香榧子油进行干预，研究其对试验性高脂血症小鼠血脂水平的影响，为香榧子油进一步开发和利用提供科学依据。

1 材料和方法

1．1 材料和试剂

香榧子:浙江省诸暨市枫桥镇;ICR小鼠:浙江省实验动物中心。

三吡啶三吖嗪(TPTZ，分析纯):sigma－Aldrich公司;1，1－二苯基苦基苯肼(DPPH，分析纯):和光纯药工业股份公司;邻菲啰啉(分析纯):中国医药(集团)上海化学试剂公司;邻苯三酚(分析纯):国药集团化学试剂有限公司;猪油:市售板油熬制;胆固醇:上海惠世生化试剂有限公司;甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL－C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL－C)试剂盒:潍坊市康华生物技术有限公司。

1．2 仪器与设备

Spe－ed SFE型超临界萃取仪:美国Applied Separations公司;Agilent 7890A型气相色谱仪:美国安捷伦公司;WK－200B型高速药物粉碎机:山东青州市精诚机械有限公司;H1650型高速台式离心机:长沙湘仪离心机设备有限公司;EL204型电子天平:梅特勒－托利多仪器上海有限公司;UNIC7200型可见分光光度计:上海精密科学仪器有限公司;DKS22型电热恒温水浴锅:上海精密实验设备有限公司。

1．3 方法

1．3．1 香榧子油的提取

将香榧子核仁粉碎，过40目筛，105℃干燥3 h，称取适量粉末装入超临界CO2萃取仪的萃取釜中，设定适宜提取工艺参数:萃取时间4 h，萃取压力45 MPa，萃取温度50℃。

香榧子油脂肪酸甲酯制备参考文献［4］。

香榧子油脂肪酸组成及成分鉴定GC条件参考文献［5］。

1．3．2 香榧子油体外抗氧化活性研究

1．3．2．1 总抗氧化活性的测定——FRAP法［6－7］

FRAP法原理为:Fe3+－TPTZ可被样品中还原物质还原为Fe2+－TPTZ形式并呈现出明显的蓝色，于593 nm处具有最大光吸收，根据吸光度的大小计算样品抗氧化能力的强弱。一般情况下，物质的还原能力越强，其抗氧化活性也越高。

TPTZ工作液的配制:0．2 mol/L醋酸盐缓冲液(pH 3．6)、10 mmol/L TPTZ(溶于40 mmol/L盐酸)、20 mmol/L FeCl33者的比例为10∶1∶1。

还原力标准曲线的绘制:取不同体积的1 mmol/L FeSO4溶液，用蒸馏水补至2 mL，再加入3 mL TPTZ工作液，混匀后于37℃反应10 min，593 nm处测定吸光度，制定还原力标准曲线。

香榧子油总抗氧化活性测定:在试管中加入一定质量浓度的香榧子油乙醇溶液2 mL，再加入3 mL TPTZ工作液，混匀后于37℃反应10 min，593 nm处测定吸光度，平行测定3次，取平均值。抗氧化能力以相同吸光度值的FeSO4当量浓度表示，记为FRAP值。同时以VC作为对照。

1．3．2．2 清除超氧阴离子自由基的能力测定——邻苯三酚自氧化法［8－9］

邻苯三酚在自氧化过程中伴有O2·－生成，在pH＜9．0时，自氧化速率与生成的O2·－浓度呈正相关，通过吸光度的变化测定抗氧化剂对O2·－的清除能力，间接评价其抗氧化能力。

邻苯三酚自氧化速率测定:在试管中加入4．5 mL 50 mmol/L Tris－HCl缓 冲 液(pH 8．2)和1．0 mL蒸馏水，混匀于37℃水浴中保温20 min后取出，立即加入已在37℃预热的3 mmol/L邻苯三酚0．5 mL，迅速摇匀倒入比色皿中，以10 mmol/L HCl溶液配制空白管作对照，325 nm处每隔30 s测定其吸光度。以时间为横坐标，吸光度值为纵坐标线性回归，其斜率为邻苯三酚自氧化的反应速率(Vblank)。

香榧子油对邻苯三酚自氧化速率的影响:按上述步骤，在加入邻苯三酚前先分别加入1 mL不同质量浓度的香榧子油乙醇溶液。同样以10 mmol/L HCl溶液配制空白管作对照，测定吸光度，每个样品平行测定3次，取其平均值。按相同的方法进行线性回归，曲线斜率记为Vsample。

1．3．2．3 清除羟基自由基的能力测定［10］

Fenton反应是生物体内产生·OH的主要来源，参照Fenton反应的方法建立反应体系。反应体系所需溶液及试剂为:PBS缓冲液(pH 7．4)、0．75 mmol/L邻菲邻菲啰啉无水乙醇、0．75 mmol/L FeSO4溶液、双氧水(0．01%)，不同质量浓度香榧子油乙醇溶液(表1)。

表1 各溶液加入反应体系体积

反应体系置于37℃恒温水浴中反应1 h后立即取出并迅速测定其在536 nm处的吸光度，平行测定3次，取平均值。

1．3．2．4 清除DPPH自由基的能力测定［11］

利用DPPH溶液的特征紫色团在517 nm处有最大光吸收，通过加入抗氧化剂后吸光度值的变化评价其清除自由基的强弱。在试管中加入不同质量浓度的香榧子油乙醇溶液及等体积的0．2 mmol/L DPPH乙醇溶液，混匀后于暗处静置30 min，以无水乙醇为参比，517 nm下测定其吸光度值，平行测定3次，取平均值。

注:A0为2 mL DPPH溶液+2 mL无水乙醇;A1为2 mL DPPH溶液+2 mL香榧子油乙醇溶液;A2为2 mL无水乙醇+2 mL香榧子油乙醇溶液。

1．3．3 香榧子油降血脂功能研究

1．3．3．1 试验动物

ICR小鼠体重在20 g左右，共50只，雌雄参半，由浙江省实验动物中心提供。

1．3．3．2 动物饲料

高脂饲料:基础饲料500 g，猪油90 g，胆固醇9 g，胆酸盐0．9 g，丙基硫氧嘧啶0．9 g，水300 mL。

1．3．3．3 分组设计

ICR小鼠适应性饲养1周后，按体重随机分为5组，即正常对照组、高脂模型组、高、中、低剂量组，每组10只，试验期为28 d，除正常对照组饲以基础饲料外，其余各组饲以高脂饲料，均自由进食和饮水。

正常对照组和高脂模型组:每天2 mL生理盐水灌胃;高剂量组:11 mL/(kg·d)样品灌胃，相当于人体推荐量的20倍;中剂量组:5 mL/(kg·d)样品灌胃，相当于人体推荐量的10倍;低剂量组:2．75 mL/(kg·d)样品灌胃，相当于人体推荐量的5倍。饲养结束后，禁食12 h，次日清晨眼眶取血，3 500 r/min离心20 min分离血清，按试剂盒说明测定血清各项指标［12－13］。

1．3．3．4 统计分析

采用SPSS17．0软件，结果以珔X±s表示，对数据进行t检验，进行方差分析及均数两两比较。

2 结果与分析

2．1 香榧子油的提取

利用超临界CO2萃取仪提取的香榧子油得率为94．57%，GC分析香榧子油脂肪酸组成结果表明，不饱和脂肪酸占总脂肪酸的87．28%，其中亚油酸、油酸和二十碳三烯酸质量分数分别为42．02%、32．14%和9．80%。

2．2 香榧子油体外抗氧化活性测定

2．2．1 总抗氧化能力

按照1．3．2．1的方法进行试验，得总抗氧化能力测定标准曲线，如图1所示。

图1 总抗氧化测定标准曲线

由图1可以看出，FeSO4浓度在0～1 mmol/mL范围内与吸光度值成良好线性关系。拟合方程:y=0．882 2x+0．031 6，相关系数R2=0．995 0。因此，以593 nm处的吸光度值换算成样品的FeSO4当量浓度的方法是可行的。

取不同质量浓度的香榧子油乙醇溶液和VC进行总抗氧化活性测定，结果如图2所示。

图2 总抗氧化能力

由图2可以看出，香榧子油总抗氧化活性随浓度的增大而提高，但弱于相同浓度下强抗氧化剂VC的总抗氧化能力。抗氧化活性反映的不是样品针对某一种自由基的清除活性，而是样品总还原能力［14］。

2．2．2 清除超氧阴离子自由基的能力

随着样品浓度的增加，其在325 nm处的OD值也增加，从而影响图的直观性。将第1分钟的OD值作为空白，用2～6 min时的OD值减去它，得到ΔA。按上述方法测定OD值，作ΔA－t的关系图3，可以直观地比较样品清除超氧阴离子自由基的强弱［9］。

图3 香榧子油对邻苯三酚吸光度的影响

由图3可以看出，反应体系OD值随时间的延长而变大;随着加入香榧子油浓度的增大反应体系OD值增长逐渐变缓。

按公式(1)计算不同质量浓度香榧子油对邻苯三酚自氧化抑制率，作浓度与抑制率关系图4。

图4 香榧子油清除超氧阴离子自由基活性

由图4可以看出，香榧子油对O2·－自由基的清除能力随浓度的增加而加强，当香榧子油质量浓度为5 mg/mL时，清除率达到57．51%，表明香榧子油对O2·－自由基具有一定的清除作用。根据拟合曲线计算香榧子油清除O2·－自由基的IC50为4．20 mg/mL。

2．2．3 清除羟基自由基的能力

按公式(2)计算不同质量浓度的香榧子油对HO·清除率，结果如表2所示。

表2 香榧子油对·OH清除率的影响

由表2可以看出，香榧子油对·OH清除率随着浓度的增加而升高，当质量浓度为4 mg/mL时，清除率达到65．22%。依据清除率曲线计算香榧子油对·OH的IC50为3．16 mg/mL。

2．2．4 清除DPPH自由基的能力

按1．3．2．4方法进行试验，由公式(3)计算不同质量浓度香榧子油对DPPH自由基的清除率，如表3所示。

表3 香榧子油对DPPH自由基清除率的影响

由表3可以看出，清除率随浓度的增加而升高;根据清除率曲线计算香榧子油清除DPPH自由基的IC50为9．20 mg/mL。

2．3 香榧子油降血脂的作用

香榧子油对小鼠血脂水平的影响见表4。

表4 香榧子油对血脂水平的影响(珔X±s，mmol/L，n=10)

由表4可以看出，与正常对照组相比，高脂模型组TG、TC和LDL－C水平显著升高(P＜0．01)，HDL－C水平显著降低(P＜0．05)，表明饲以高脂饲料造成了小鼠的高脂血症模型。与高脂模型组相比，高剂量组血清TC、LDL－C水平(P＜0．05)和TG水平(P＜0．01)显著降低，HDL－C水平显著升高(P＜0．05);中剂量组血清TG和LDL－C水平显著降低(P＜0．05)，HDL－C水平显著升高(P＜0．05)，TC水平虽有降低，但无显著变化(P＞0．05);低剂量组血清TG、TC和LDL－C水平降低，HDL－C水平升高，但无统计学意义(P＞0．05)。表明香榧子油能干预试验性高脂血症小鼠血脂水平的升高，具有一定的防治作用。

3 讨论与结论

香榧子油不饱和脂肪酸占总脂肪酸的87．28%，其中亚油酸、油酸和二十碳三烯酸质量分数分别为42．02%、32．14%和9．80%。不饱和脂肪酸是人体生命活动必不可少的重要物质，具有调节血脂水平、清除体内自由基、软化血管、延缓衰老等作用［15］。

通过对总抗氧化活性、清除超氧阴离子自由基、羟基自由基和DPPH自由基的研究试验，表明香榧子油具有一定的抗氧化活性;对羟基自由基的清除能力强于超氧阴离子自由基，DPPH自由基次之，IC50分别为3．16、4．20和9．20 mg/mL。

通过对小鼠血脂水平的影响结果可以看出，与高脂模型组相比，香榧子油剂量组TG、TC和LDL－C水平显著降低(P＜0．01或P＜0．05)，HDL－C水平显著升高(P＜0．05)，并呈现一定的量效关系，表明香榧子油具有改善血脂水平的功能，其调节血脂水平的作用机制可能与亚油酸、油酸等不饱和脂肪酸油有关，大量研究表明油酸和亚油酸对心脑血管疾病有防治作用［16］，Spady［17］以高脂血症大鼠为研究对象，结果表明亚油酸可显著降低血清TG和TC含量;Laaksonen等［18］研究表明亚油酸和n－3多不饱和脂肪酸在防治心脑血管疾病上具有协同增效作用。

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Study on Antioxidant Activity and Reducing Blood Fat Function of Kaga Oil

Xu Chao Wang Hongfei Shao Xingfeng Yu Wenwen
(Institute of Life Science and Biotechnology，Ningbo University，Ningbo 315211)

This article sudies the antioxidant activity of kaga oil by supercritical CO2extraction and reducing blood fat function．The antioxidant activity of TGO is evaluated based on total antioxidant power，O2·－，HO·and DPPH free radical scavenging activities．It also experiments the kaga oil's influences to TG、TC、HDL－C and LDL－Cof mouth's blood and investigates the function of reducing blood fat．The result shows that kaga oil can eliminate radicals effectively and the IC50values of O2·－，HO·and DPPH radicals sre 3．16 mg/mL，4．20 mg/mL and 9．20 mg/mL respectively．Compared with high fat model groups，the contents of TG，TC and LDL －C are significantly reduced(P＜0．01 or P＜0．05)，but the HDL －Cis significantly increased(P＜0．05)．Kaga oil has some kind of antioxidant activities and significant reducing blood fat functions．

kaga oil，antioxidant activity，free radical，reducing blood fat

TS229 文献标示码:A

1003－0174(2012)08－0043－05

宁波大学人才基金(2006244)

2011－10－31

徐超，男，1988年出生，硕士，农产品加工

王鸿飞，男，1964年出生，教授，农产品加工，食品科学