王宏魁，李清州，毛 薇

（1.郑州牧业工程高等专科学校，河南 郑州450011；2.河南省农业科学院 农业经济与信息研究中心，河南 郑州450002；3.河南省郑州市铁路职业技术学院，河南 郑州450052）

猪链球菌是一种重要的人兽共患病病原，可引起猪的脑膜炎、关节炎、败血症、心内膜炎、脑炎、流产、多发性浆膜炎和支气管肺炎，发病猪群死亡率可达80%。该菌分为35个血清型，其中血清1（14）、2（1／2）、7、9型是病猪中经常流行的血清型，与动物致病性有很大关系［1］，其中，以2型危害巨大，人可以感染发病而导致败血症、脑膜炎、心内膜炎和永久性耳聋等［2－5］，甚至引起死亡，引起极大的公共卫生关注。本试验于2009年7月至2010年1月，在河南省14个地市33个猪场送检的病猪中无菌采集腭扁桃体样品83份，进行了猪链球菌的检测及分离鉴定，以期为研制猪链球菌新型疫苗和新型检测方法提供试验材料。

1 材料与方法

1.1 病料的采集 2009年7月至2010年1月从河南省不同地市送诊的临床发病猪体内采集腭扁桃体样品，于－20℃条件下保存备用。

1.2 参考菌株和主要试剂 参考菌株猪链球菌1型SH28，2型S735由中国动物卫生与流行病学中心范伟兴教授惠赠，猪链球菌7型、9型菌株由河南农业大学传染病教研室分离保存。阴性对照菌株马链球菌兽疫亚种（C群，CVCC562），购自中国兽医药品监察所。DL－2 000DNA Marker、rTaqDNA聚合酶，均为宝生物工程（大连）有限公司产品；BactoTMTodd Hewitt Broth（THB），购自 BD 公司；DNA胶回收试剂盒，购自百泰克生物技术（北京）有限公司。

1.3 猪链球菌的分离鉴定 用无菌接种环挑取扁桃体样品划线接种于绵羊血琼脂平板，37℃温箱倒置培养16～20h，挑取单个疑似菌落再次划线接种于血平板进行纯化，经革兰染色镜检后，挑取单个菌落转接入5mL THB液体培养基（30g／L）中，37℃恒温水浴振荡培养16～20h，抽提基因组DNA，进行PCR鉴定。

1.4 引物的设计与合成 参照Smith等［4］介绍的方法，以 GenBank中收录的猪链球菌1（14）、2（1／2）、7、9型型特异的cps1I、cps2H、cps7H、cps9G基因序列（序列号分别为：AF155804、EF539837、AF164515、AF155805）为参考，利用Primer 5.0和Oligo 6.0分别设计4对引物。猪链球菌菌种鉴定引物使用Ogi等［6］公布的引物序列。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成（表1）。

表1 PCR引物

1.5 基因组DNA的提取 取200μL菌液于1.5 mL Eppendorf管中，4℃12 000r／min离心1min。弃上清液，加入1mL TE溶液（10mmol／L Tris－HCl，1mmol／L EDTA，pH 值8.0）悬浮洗涤1次。4℃12 000r／min离心1min。弃上清液，加入100 μL TE溶液，重新悬浮。100℃煮沸5min，冷却至室温。12 000r／min离心1min。取上清直接PCR或保存于－20℃备用。

1.6 PCR扩增 分两次PCR进行。猪链球菌种及其1、2、7型四重PCR扩增反应体系：10×Buffer 5μL、MgCl2（25mmol／L）5μL、dNTPs（10mmol／L each）1μL、上下游引物（20μmol／L）gdh与cps7H各1.2μL，cpslI与cps2H各1μL、模板 DNA 2 μL、rTaqDNA聚合酶（5U／μL）0.5μL，加 ddH2O至50μL。猪链球菌9型单一PCR扩增反应体系：10×Buffer 5μL、MgCl2（25mmol／L）5μL、dNTPs（10mmol／L each）1μL、上下游引物（20μmol／L）各1μL、模板DNA 2μL、rTaqDNA聚合酶（5U／μL）0.5μL，加ddH2O至50μL。反应参数均为：95℃ 预变性5min；94℃ 变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共40个循环；72℃终延伸7min。取5μL PCR产物于1%琼脂糖凝胶中进行电泳，然后在紫外检测仪下观察，并用凝胶成像仪拍照保存。抽取部分猪链球菌菌株PCR扩增产物，胶回收纯化目的基因片段，送往上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定。

2 结果与分析

2.1 猪链球菌形态学观察 猪链球菌均呈针尖状大小，灰白色或灰色，α溶血（不完全溶血，草绿色溶血环）、β溶血（透明溶血环，完全溶血）或γ溶血（不溶血）。其中猪链球菌9型PY－2株的形态灰白色，针尖状，α溶血。革兰染色后的猪链球菌呈革兰染色阳性、圆形或卵圆形，成对或长、短链状排列。

2.2 猪链球菌PCR鉴定 部分菌株经PCR扩增后，经1%琼脂糖凝胶电泳检测结果见图1。分别扩增到了大小约689bp、542bp、441bp和232bp的特异性条带，与预期扩增结果相符。

图1 部分菌株的PCR检测结果

2.3 部分菌株PCR扩增产物的测序验证 抽取猪链球 菌 NYDZ－3、HBQX－6、ZMDSC－2、ZKXH－2、LY－3、AY－1、HBQX－2、HBQX－1、PY－2、PDSWG－1株PCR扩增产物进行序列测定，所有测序结果均与预期一致，测序结果已递交GenBank，登录号为GU358478－GU358486和GU223113，从分子水平上验证了该PCR的准确性。

2.4 分离的菌株总结 结果表明，在河南14个地市33个猪场的83份病猪扁桃体样品中，有68份猪链球菌分离阳性，占81.9%，共分离到猪链球菌77株，总分离率为92.8%，其中血清2型7株，占8.4%；7型3株，占3.6%；9型4株，占4.8%；其他型63株，占75.9%，未分离到1型。分离的菌株以2型为最多，其次是9型和7型。在河南省14个地市的猪链球菌分离株中，有6个地市分离到血清2型，分别是：驻马店、平顶山、周口、南阳、洛阳、鹤壁。在安阳、鹤壁和濮阳3个地市分离到血清7型。在周口、濮阳、鹤壁和济源4个地市分离到血清9型。其中在鹤壁市同时分离出血清2、7、9三个型，濮阳市同时分离出血清7型和9型，周口市同时分离出血清2型和9型。

3 讨论

猪链球菌常存在于健康猪和病猪的扁桃体中。健康猪扁桃体的带菌率为0%～70%，有的甚至高达100%［6］。李春玲等［7］对广东省401个屠宰猪的调查结果为：SS为154份，占38.4%，其中2型17.2%，9型8.7%，7型和l型分别为2.2%和0.7%。本研究采用PCR法从河南14个地市83只病猪的68只扁桃体内共分离检测到猪链球菌77株，阳性检出率达81.9%，分离率为92.8%，其中2型7株，占8.4%；7型3株，占3.6%；9型4株，占4.8%；其他未知血清型占75.9%，河南省14个地市中有9个地市存在猪链球菌血清2、7、9型，并且以2型为最多，存在于其中的6个地市，其次是9型，在4个地市中分离到，然后是7型，存在于3个地市，说明在河南省广泛存在猪链球菌及其主要致病型血清2、7、9型。迄今为止，没有分离到血清1型，说明河南省可能不存在该血清型。

表2 河南省14个地市病猪腭扁桃体猪链球菌的分离情况（份）

河南省猪链球菌呈多重感染状况，多个血清型或与多个病原同时或继发感染。在鹤壁某猪场同时分离到了猪链球菌血清2、7、9型，但单一血清型分离自不同猪只。在1份病料中同时分离到了猪链球菌2型及其他2个未知血清型菌株的样品有5份，分别自南阳、驻马店、周口、平顶山、洛阳。在一份病料中同时分离到了猪链球菌9型及其他血清型两个菌株的样品有2份，分别来自濮阳、周口。说明河南省猪场内普遍存在多种血清型猪链球菌同时感染的情况。另外，猪链球菌与其他病毒和细菌混合感染普遍存在，分离到猪链球菌的猪只大多都有HC、PCV、HPS和MPS单一或二重、甚至三重、四重感染。比如：分离到血清2型猪链球菌的7只猪都有HC、PCV单个或双重病毒感染、有1只猪存在MPS感染，有2只猪（2只背景不详除外）呈现猪链球菌病的特征性表现，关节肿、皮发红、偶有神经症状。

猪链球菌血清1（14）、2（1／2）、7、9型是病猪中经常流行的血清型，与动物致病性有很大关系［1］。此次分离到的菌株毒力强弱、致病性如何以及在猪只发病中扮演那种角色，有待于进一步研究。目前，河南省尚缺乏猪链球菌致病血清2、7、9型的相关报道，本试验阐明了河南省现阶段猪链球菌不同血清型的流行状况，为该病的诊断防制以及疫苗的选用提供了新的思路，同时提供了丰富的背景明确的菌株，方便了下一步生产和科研工作的开展。

［1］Wisselink H J，Smith H E，Stockhofe－Zurwieden N，etal.Distribution of capsular types and production of muramidasereleased protein（MRP）and extracellular factor（EF）ofStreptococcussuisstrains isolated from diseased pigs in seven European countries［J］.Vet Microbiol，2000，74：237－248.

［2］Ishigaki K，Nakamura A，Iwabuchi S，etal.A case ofStreptococcussuisendocarditis，probably bovine－transmitted，complicated by pulmonary embolism and spondylitis［J］.Kansenshogaku Zasshi，2009，83（5）：544－548.

［3］Navacharoen N，Chantharochavong V，Hanprasertpong C，etal.Hearing and vestibular loss inStreptococcussuisinfection from swine and traditional raw pork exposure in northern Thailand［J］.J Laryngol Otol，2009，123（8）：857－862.

［4］Haleis A，Alfa M，Gottschalk M，etal.Meningitis caused byStreptococcussuisserotype 14，North America［J］.Emerg Infect Dis，2009，15（2）：350－352.

［5］Hidalgo A，Palacios R，Santos J.Streptococcussuismeningitis in Spain［J］.Enferm Infecc Microbiol Clin，2009，27（3）：195.

［6］Ogi Okwumabua，Michael O′Connor，Eileen Shull.A polymerase chain reaction（PCR）assay specific forStreptococcus suisbased on the gene encoding the glutamate dehydrogenase［J］.FEMS Microbiology Letters，2003，218：79－84.

［7］李春玲，余炜烈，贾爱卿，等.应用多重PCR检测屠宰猪扁桃体中的猪链球菌［J］.中国预防兽医学报，2008，30（5）：344－348.