双歧杆菌对应激模型大鼠肠道通透性的影响Δ

2012-11-22冀建伟付蕾郑鹏远张军郑州大学第二附属医院郑州45004郑州大学药学院郑州45000

中国药房 2012年17期

冀建伟，付蕾，郑鹏远，张军（.郑州大学第二附属医院，郑州45004；.郑州大学药学院，郑州45000）

冀建伟1＊，付蕾2，郑鹏远1#，张军1（1.郑州大学第二附属医院，郑州450014；2.郑州大学药学院，郑州450001）

目的：研究双歧杆菌对应激模型大鼠肠道通透性的影响及其与蒙脱石散联用的协同作用。方法：取SD大鼠50只随机均分为正常对照组、模型对照组、双歧杆菌干预组（2×108cfu）、蒙脱石散干预组（0.6g·kg－1）及其联合干预组（双歧杆菌2×108cfu+蒙脱石散0.6g·kg－1），每日灌胃给药1次，连续给药7d，后4组每日给药后以避水压力模型（WAS）方法建立大鼠应激模型。第8天各组分别灌胃给予探针药物甘露醇80mg、三氯蔗糖60mg，检测各组大鼠给药后5、24h尿液中甘露醇、三氯蔗糖的量及其比值，以评价肠道通透性。实验结束处死大鼠，检测各组大鼠血清中促肾上腺皮质激素释放因子（CRF）和促肾上腺皮质激素（ACTH）的含量。结果：与正常对照组比较，模型对照组大鼠24h尿液中甘露醇的量及血清中CRF、ACTH含量均明显升高（P＜0.05）；与模型对照组比较，双歧杆菌干预组和联合干预组ACTH含量均明显降低（P＜0.05），其余指标均有降低，但没有统计学意义。结论：双歧杆菌对应激模型大鼠的肠道通透性有影响，其与蒙脱石散联用对应激所致的肠道屏障功能紊乱无协同作用。

双歧杆菌；应激模型；大鼠；肠道通透性；蒙脱石散

益生菌是人类肠道的原籍菌，在维持宿主胃肠道正常生理功能中发挥着重要作用。双歧杆菌是人类肠道最早发现的益生菌，极具研究价值。尽管大量的数据显示，益生菌能够调节肠道免疫[1]、阻滞病原菌黏附、提高黏膜屏障功能[2，3]，但其在应激所致的肠道屏障功能紊乱中的治疗作用研究较少。蒙脱石散是临床上常用的肠道黏膜屏障保护剂，是一种特有的不吸收、不会造成全身性不良反应，且应用方便、经济的口服制剂。蒙脱石散在维持肠道黏膜机械屏障、稳定肠道微生态环境等方面可发挥重要作用，能够有效地预防和控制肠道病原菌生物移位的发生。在本实验中，笔者拟以避水压力模型（WAS）方法模拟环境和心理压力建立应激模型大鼠，研究双歧杆菌对应激模型大鼠肠道通透性的影响及其与蒙脱石散联用是否具有协同作用。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Spectra MR型酶标仪（美国Dynex公司）；Agilent 6890N气相色谱仪（美国Agilent科技有限公司）。

1.2 试药

蒙脱石散（博福-益普生（天津）制药有限公司，批号：T0461，规格：每袋3g）；大鼠促肾上腺皮质激素释放因子（CRF）、促肾上腺皮质激素（ACTH）酶联免疫吸附检测（ELISA）试剂盒（美国ADL公司）；甘露醇（比利时Acros公司，纯度：98%）；三氯蔗糖（纯度：99%）、α-D-甲基甘露糖苷（内标1，纯度：99%）、蔗糖（内标2，纯度：99%）均由美国Sigma公司提供。

1.3 益生菌

双歧杆菌（郑州大学医学微生态学研究所，分离自内蒙古双奇药业股份有限公司生产的双歧杆菌乳杆菌三联活菌片）。

1.4 动物

SD大鼠，♀，清洁级，体重（200±20）g，由郑州大学实验动物中心提供，合格证号为SCXK（豫）2005-0001。

2 方法

2.1 分组与给药

取大鼠50只，随机均分为正常对照组（生理盐水2mL）、模型对照组（生理盐水2mL）、双歧杆菌干预组（2×108cfu）、蒙脱石散干预组（0.6g·kg－1）及其联合干预组（双歧杆菌2×108cfu+蒙脱石散0.6g·kg－1），每日上午8：00灌胃给予相应药物1次，连续给药7d。

2.2 建模

采用WAS方法。每日称重、给药后，除正常对照组外其余各组大鼠均放置于一个8cm×6cm的平台上，平台固定在一个直径50cm、深50cm的有水塑料容器内，离水面的距离为1cm[2]，每次放置2h（上午8：00－10：00）。

2.3 肠道通透性测定

本实验以大鼠尿液中甘露醇、三氯蔗糖的量及其比值来评价其肠道通透性。

2.3.1 糖摄取与尿液采集。实验第8天上午8：00，各组大鼠分别灌胃给予探针药物甘露醇80mg、三氯蔗糖60mg，然后放入大鼠代谢笼，3h后自由饮水，整个过程中禁食[4]。收集给药后5h及其后19h尿液，记录尿液体积。实验结束后将采集到的尿液置于－20℃条件下储存，待测。

2.3.2 样品的制备。取给药后5h及其后19h尿液各100μL，分别加入20μL混合内标溶液（含5mg·mL－1内标1与2mg·mL－1内标2），混匀后70℃下氮气吹干，干燥物加入200μL含25mg·mL－1盐酸羟胺的无水吡啶溶液，70℃反应1h后，2250r·min－1离心5min，取100μL上清液至小锥形瓶中，加入100μL N-三甲硅烷基咪唑，70℃反应30min，将得到含硅烷化衍生物的尿液密封储存于－20℃冰箱中，待测。另向正常健康大鼠的空白尿液中加入已知量的混合探针药物制成标准品（高、中、低3个浓度的质控样品）进行平行分析。

2.3.3 色谱条件。色谱柱：HP-5（5%苯甲基硅烷）柱（30m×320μm，0.25μm）；载气：氮气，流速：1.0mL·min－1；柱温[5]：程序升温，初始温度220℃，保持5min，然后以10℃·min－1升温2min，5℃·min－1升温4min，3.5℃·min－1升温4min后达到最终温度274℃，保持7min，整个操作时间为22min；检测器：氢火焰离子化检测器（FID）；检测器温度：280℃；进样口温度：250℃；手动进样；进样量：2μL。同时检测甘露醇和三氯蔗糖的量。每种糖的含量由相应标准品的保留时间（tR）来确定，按内标标准曲线法计算样品中每种糖的量，甘露醇的量：m甘/m内标1＝A甘/A内标1，三氯蔗糖的量：m三/m内标2＝A三/A内标2。式中，m甘：甘露醇的质量，m内标1：内标1的质量，A甘：甘露醇的峰面积，A内标1：内标1的峰面积，m三：三氯蔗糖的质量，m内标2：内标2的质量，A三：三氯蔗糖的峰面积，A内标2：内标2的峰面积。在上述色谱条件下，内标1、甘露醇、内标2、三氯蔗糖的保留时间分别是3.5、4.6、13.7、14.6min。

2.3.4 系统适用性与方法学研究。在“2.3.3”项色谱条件下，甘露醇峰和三氯蔗糖峰与其相邻杂质峰的分离度均大于1.5，理论板数均大于6000，拖尾因子在0.95～1.05之间，RSD小于2%。甘露醇检测浓度在0.5～20mg·mL－（1r＝0.999，n＝8）、三氯蔗糖检测浓度在0.05～2mg·mL－（1r＝0.998，n＝8）范围内线性关系良好。日内、日间RSD均小于10%，相对回收率均大于90%。

2.4 血清中CRF、ACTH含量的检测

实验结束日处死大鼠，收集各组大鼠血液，室温下凝固20min，4℃、4000r·min－1离心30min，分离血清，采用CRF、ACTH ELISA试剂盒测定各组大鼠血清中CRF和ACTH的含量，以确定大鼠是否产生应激反应。

2.5 统计学处理

3 结果

3.1 肠道通透性指标

给药后5h，各组大鼠肠道通透性指标比较无显著性差异。与正常对照组比较，模型对照组大鼠给药后24h尿液中甘露醇的量明显升高（P＜0.05），表明应激条件下大鼠肠道通透性增强。各组大鼠尿液中甘露醇、三氯蔗糖的量见表1。

表1 各组大鼠尿液中甘露醇、三氯蔗糖的量比较（mgn＝10）Tab 1Comparison of the amount of mannitol and sucralose in urin（emg

与正常对照组比较：＊P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.05

给药后5h三氯蔗糖4.198±0.3123.700±0.3533.619±0.2683.645±0.3063.625±0.298组别正常对照组模型对照组双歧杆菌干预组蒙脱石散干预组联合干预组甘露醇1.849±0.2062.163±0.2761.996±0.1882.030±0.2941.924±0.309三氯蔗糖1.780±0.1911.987±0.2291.837±0.2701.870±0.3131.862±0.225给药后24h甘露醇3.774±0.3194.078±0.362＊3.802±0.2903.861±0.3353.845±0.296

3.2 血清中CRF、ACTH含量变化

与正常对照组比较，模型对照组大鼠血清中CRF、ACTH含量均明显升高（P＜0.05）。与模型对照组比较，双歧杆菌干预组和联合干预组大鼠血清中ACTH含量均明显降低（P＜0.05）。表明在应激条件下，大鼠的神经内分泌处于应激状态，而双歧杆菌对这种应激状态有缓解作用。各组大鼠血清中CRF、ACTH含量比较见表2。

表2 各组大鼠血清中CRF、ACTH含量比较（pg·L－1n＝10）Tab 2Comparison of serum levels of CRF and ACTH in each grou（ppg·L－1

与正常对照组比较：＊P＜0.05；与模型对照组比较：#P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.05；vs.model control group：#P＜0.05

项目CRF ACTH组别联合干预组277.8±31.95.94±0.650#正常对照组267.0±32.35.68±0.799模型对照组300.8±34.3＊6.79±0.651＊双歧杆菌干预组279.5±29.65.92±0.477#蒙脱石散干预组281.6±32.36.24±0.787

4 讨论

近年来，社会心理因素对压力相关性（Stress-associated）疾病如肥胖、代谢综合征、2型糖尿病以及疼痛和慢性疲劳综合征的影响日益受到关注[6，7]。越来越多的学者认为生活压力能够导致或加重功能性肠病如肠易激综合征（IBS）[8，9]以及炎症性肠病（IBD）如克罗恩病、溃疡性结肠炎[9，10]。IBS是一种最常见的消化系统功能性疾病，近年的发病率亦逐年升高。研究[11]发现，应激刺激能够影响胃肠道的蠕动、分泌等功能，并且可以增加旁细胞途径的渗透，而IBS和IBD患者大多存在肠道屏障功能紊乱。肠道通透性测定是评估肠道屏障完整性最直接、准确的方法。肠道通透性可以通过测定口服摄入大分子探针药物在尿液中的排泄来完成[12]。应用最广泛的探针药物是糖类化合物，如蔗糖、甘露醇、乳果糖等。其中，口服甘露醇和三氯蔗糖在胃肠道的不同部位被较少吸收，大部分以原型通过粪便排泄，其余以原型从尿液排泄[13]。因此，口服一定量的糖探针溶液，并测定其在尿液中的排泄量，就可以选择性地反映胃肠道不同位置的屏障完整性。乳果糖与甘露醇比例曾是许多科研和临床研究中评估小肠通透性的重要工具。但由于乳果糖易被结肠细菌分解，改变结肠pH并可能改变结肠微生物群、改变肠道通透性，因此不宜选用。三氯蔗糖是蔗糖氯化后的一种人工合成二糖，其不仅对热稳定，而且在通过整个消化道时几乎不被代谢，并且与蔗糖和乳果糖有相似的分子量。因此本实验选用甘露醇和三氯蔗糖作为检测大鼠肠道通透性的探针药物。

毛细管气相色谱法（CCGC）是一种研究肠道通透性的新方法，具有实用、可重复、准确、灵敏度高等优点。本实验采用CCGC法，2种糖都能在相同条件下同时检测，降低了误差。笔者在预实验中发现由于甘露醇与三氯蔗糖在CCGC中tR相差较大（＞8），因此选择了双内标法进行测定。在本实验中，24h大鼠排泄的三氯蔗糖和甘露醇几乎一半出现在了5h尿液中，另外一半出现在后19h的尿液中。一般认为前5h为糖探针通过小肠以上胃肠道特别是小肠的时间，而后19h则代表其通过大肠特别是结肠的时间[14]。本实验中，与正常对照组比较，应激模型大鼠前5h的肠道通透性无变化，而24h的肠道通透性发生改变，说明WAS应激可能对结肠的通透性影响较大。

应激模型大鼠出现肠道通透性的改变可能与CRF有关。笔者前期体外研究显示肠黏膜嗜酸细胞在SP（Substance P）的作用下可以产生并释放CRF[15]，而使用CRF受体阻滞药可以显著改善应激所导致的肠道屏障功能紊乱[16]。在本实验中，应激模型大鼠出现肠道通透性改变，血清中CRF、ACTH含量明显升高，而双歧杆菌干预组和联合干预组的ACTH含量明显降低，且接近正常对照组，说明应激能够导致大鼠神经内分泌紊乱，而双歧杆菌对应激模型大鼠的肠道通透性有影响。但应激模型大鼠出现肠道屏障功能紊乱与CRF之间的具体关系目前尚不清楚，仍需进一步研究。

与双歧杆菌干预组和蒙脱石散干预组比较，联合干预组大鼠的肠道通透性指标血清中CRF、ACTH含量均无显著性差异，说明双歧杆菌与蒙脱石散联用对应激所致的肠道屏障功能紊乱无协同作用。

[1] 张利利，郑鹏远，罗予，等.双歧杆菌对食物过敏小鼠肠道屏障功能及Th1/Th2细胞因子的影响[J].世界华人消化杂志，2009，17（11）：1091.

[2] Zareie M，Johnson-Henry K，Jury J，et al.Probiotics prevent bacterial translocation and improve intestinal barrier function in rats following chronic psychological stress[J].Gut，2006，55（11）：1553.

[3] Gareau MG，Jury J，MacQueen G，et al.Probiotic treatment of rat pups normalises corticosterone release and ameliorates colonic dysfunction induced by maternal separation[J].Gut，2007，56（11）：1522.

[4] Meddings JB，Gibbons I.Discrimination of site-specific alterations in gastrointestinal permeability in the rat[J].Gastroenterology，1998，114（1）：83.

[5] Farhadi A，Keshavarzian A，Holmes EW，et al.Gas chromatographic method for detection of urinary sucralose：application to the assessment of intestinal permeability[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2003，784（1）：145.

[6]Miller G，Chen E，Cole SW.Health psychology：developing biologically plausible models linking the social world and physical health[J].Annu Rev Psychol，2009，60：501.

[7] Muscatell KA，Slavich GM，Monroe SM，et al.Stressful life events，chronic difficulties，and the symptoms of clinical depression[J].J Nerv Ment Dis，2009，197（3）：154.

[8] Santos J，Alonso C，Vicario M，et al.Neuropharmacology of stress-induced mucosal inflammation：implications for inflammatory bowel disease and irritable bowel syndrome[J].Curr Mol Med，2008，8（4）：258.

[9] Stengel A，Taché Y.Neuroendocrine control of the gut during stress：corticotropin-releasing factor signaling pathways in the spotlight[J].Annu Rev Physiol，2009，71：219.

[10] Maunder RG，Levenstein S.The role of stress in the development and clinical course of inflammatory bowel disease：epidemiological evidence[J].Curr Mol Med，2008，8（4）：247.

[11] Mazzon E，Sturniolo GC，Puzzolo D，et al.Effect of stress on the paracellular barrier in the rat ileum[J].Gut，2002，51（4）：507.

[12] O’Brien DP，Nelson LA，Kemp CJ，et al.Intestinal permeability and bacterial translocation are uncoupled after small bowel resection[J].Pediatr Surg，2002，37（3）：390.

[13] Johnston SD，Smye M，Watson RP.Intestinal permeability tests in coeliac disease[J].Clin Lab，2001，47（3-4）：143.

[14] Anderson AD，Jain PK，Fleming S，et al.Evaluation of a triple sugar test of colonic permeability in humans[J].Acta Physiol Scand，2004，182（2）：171.

[15] Zheng PY，Feng BS，Oluwole C，et al.Psychological stress induces eosinophils to produce corticotrophin releasing hormone in the intestine[J].Gut，2009，58（11）：1473.

[16]Teitelbaum AA，Gareau MG，Jury J，et al.Chronic peripheral administration of corticotropin-releasing factor causes colonic barrier dysfunction similar to psychological stress[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2008，295（3）：G452.

Influence of Bifidobacterium on the Intestinal Permeability in Stress Model Rats

JI Jian-wei，ZHENG Peng-yuan，ZHANG Jun（The Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450014，China）
FU Lei（School of Pharmacy，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001，China）

OBJECTIVE：To study the improvement effect of Bifidobacterium on intestinal permeability in stress model rats，and synergistic reaction of Bifidobacterium combined with Montmorillonite powders.METHODS：50SD rats were randomly divided into normal control group，model control group，Bifidobacterium treatment group（2×108cfu），Montmorillonite powders treatment group（0.6g·kg－1）and drug combination group（Bifidobacterium 2×108cfu+Montmorillonite powders 0.6g·kg－1）.Those rats were given medicine once a day via i.g.for consecutive 7days.Stress model was established by WAS in the latter 4groups.On 8th day each group was given mannitol 80mg and sucralose 60mg，and the amount and ratio of mannitol and sucralose in urine were determined 5h and 24h after administration to evaluate intestinal permeability.Rats were sacrificed at the end of experiment，and the content of corticotrophin releasing factor（CRF）and adrenocorticotrophic hormone（ACTH）in serum were determined.RESULTS：Compared with normal control group，the 24h mannitol concentration，the serum levels of CRF and ACTH in model control group increased significantly（P＜0.05）.Compared with model control group，serum levels of ACTH in Bifidobacterium treatment group and drug combination group decreased significantly（P＜0.05）.Other parameters all decreased but had no statistical significance.CONCLUSION：Bifidobacterium can improve intestinal permeability of stress model rats，protect intestinal mucosa.In the treatment of intestinal dysfunction caused by chronic psychological stress，Bifidobacterium and Montmorillonite powders are not in synergies.

Bifidobacterium；Stress model；Rats；Intestinal permeability；Montmorillonite powders

R965

1001-0408（2012）17-1543-03

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2012.17.03

Δ国家自然科学基金资助项目（30772028）

＊药师。研究方向：消化系统药物临床合理应用。电话：0371-63974693。E-mail：jiwei_2002@163.com

#通讯作者：教授，博士研究生导师。研究方向：消化系统药物临床合理应用。电话：0371-63974693

2011-05-16

2011-08-04）