李张军 方志源 曾因明 文先杰

近年来，T型钙通道在神经病理性疼痛中的作用受到人们普遍关注，我们以前的研究发现，鞘内注射T型钙通道阻断剂米贝地尔能使慢性坐骨神经松结扎大鼠痛阈的升高［1］，但是T型钙通道各个亚型在神经病理性疼痛中的作用目前尚无定论。Cav3.3是T型钙通道的一种亚型，本实验通过建立大鼠背根节慢性压迫痛模型，应用行为学观察的方法，探讨Cav3.3亚型在神经病理痛中的作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器 反义寡聚核苷酸以大鼠Cav3基因序列为基础设计，由上海生工合成［2］，序列如下:Cav3.3反义寡聚核苷酸5'-GCT GAG GGC GGC TTG TGT TT-3'，错义寡聚核苷酸作为反义寡聚核苷酸处理的对照组，序列如下:5'-TAC TGT ACT TGC GAG GCC AC-3'，使用前用生理盐水稀释。抗Cav3.3抗体购自美国Santa Cruz公司，辣根酶标记兔抗山羊IgG和DAB试剂盒购自北京中山公司。von Frey纤维丝和热痛刺激仪BME-410A分别购自美国Stolting公司和中国医学科学院生物工程研究所。

1.2 实验动物与分组 健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠48只，体重250～280 g，由徐州医学院实验动物中心提供。行为学实验包括32只大鼠，随机分为4组(n=8)，即CCD+NS组:鞘内注射生理盐水;CCD+Cav3.3-AS组:鞘内注射Cav3.3反义寡聚核苷酸;CCD+Cav3.3-MM组:鞘内注射Cav3.3错义寡聚核苷酸;sham+NS组:鞘内注射生理盐水。各组大鼠在鞘内置管成功后5 d行CCD手术或sham手术，术后第1天起，连续4 d每天两次，鞘内分别注射12.5 μg，容积均为10 μl的反义、错义寡聚核苷酸或10 μl生理盐水。分子生物学western blot实验每组4只(n=4)。

1.3 CCD模型的建立 参照胡三觉等［3］方法。SD大鼠在1%戊巴比妥40 mg/kg腹腔注射麻醉后，沿 L4～6棘突右侧切皮，分离脊椎右侧肌肉，暴露L4～6横突及其间的椎间孔，用弯成直角的长4 mm，直径0.7 mm的钢棒，以与背部正中线成30度以及与脊柱侧面水平线成10度向头背端插入L4和L5椎间孔(深度约3～4 mm)。假手术组(sham)仅暴露L4、L5横突和椎间孔，不插入钢棒。

1.4 鞘内置管 大鼠腹腔注射1%戊巴比妥40 mg/kg麻醉，采用Yaksh法［4］，行鞘内置管术，大鼠清醒24 h后观察其活动情况，剔除出现运动功能障碍的大鼠不用。术后第3天用2%利多卡因10 μ l经导管注射来判断导管的位置，如注射后30 s内大鼠出现双后肢麻痹说明导管位置正确。5 d后即可用于实验。实验时每次给药后用10 μl生理盐水冲洗PE管。

1.5 行为学测定 用von Frey细丝测定大鼠的机械性缩足阈值(mechanical withdrawal threshold，MWT)，用热辐射法测定大鼠热缩足潜伏期(thermal withdrawal latency，TWL)。各组大鼠在手术前两天测定基础痛阈及手术后1至14 dMWT和TWL。

1.5.1 MWT的测定 用Von Frey纤维丝以up-down法推算50%缩足阈值［5］:测定首先从2 g开始，当该力度的刺激不能引起阳性反应，则给予相邻大一级力度的刺激;如出现阳性反应则给予相邻小一级力度的刺激，如此连续进行，直至出现第一次阳性和阴性反应的骑跨，再连续测定4次。

1.5.2 TWL的测定 应用热刺激仪照射大鼠足底，记录从照射开始至出现足逃避反射的时间(s)，此即为热刺激缩足潜伏期;重复测量3次，取其平均值作为热刺激缩足潜伏期并作为定量指标［6］。

1.6 统计学方法 采用SPSS 10.0统计软件进行分析和Excel软件制图，各组数据以均数±标准差(±s)表示，组内比较采用t检验，组间比较采用多因素方差分析(one-way ANOVA)，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 鞘内注射Cav3.3反义寡聚核苷酸对CCD大鼠热痛阈的影响 除SHAM组外各组大鼠的热痛阈在术后第1 d均降低，CCD+Cav3.3-AS组热痛阈在术后第3～5 d(P＜0.01)明显高于CCD+NS组。直到术后第10 d CCD+Cav3.3-AS组大鼠才形成与NS组相似的热痛敏。Cav3.3-MM组大鼠热痛敏的形成与NS组无差别(P＞0.05)。(见表1)。

2.2 鞘内注射Cav3.3反义寡聚核苷酸对CCD大鼠机械痛阈的影响 除SHAM组外各组大鼠在术后1 d就表现为明显的触诱发痛，CCD+Cav3.3-AS组大鼠在术后第3 d虽然机械痛阈也明显降低，但比NS组明显要高(P＜0.01)，直到术后第10 d，Cav3.3-AS组大鼠才形成与NS组一样稳定的机械痛敏(P＞0.05)，Cav3.3-MM组大鼠机械痛敏的形成与NS组无差别(P＞0.05)。(见表2)。

表1 鞘内注射Cav3.3反义寡聚核苷酸对CCD大鼠热痛阈的影响( ± s，n=8)

表1 鞘内注射Cav3.3反义寡聚核苷酸对CCD大鼠热痛阈的影响( ± s，n=8)

注:*P＜0.05，＊＊P＜0.01 VS CCD+NS组.

组别TWL(s)术前 术后1 术后3 术后5 术后7 术后10 术后14 CCD+NS 20.1±2.2 15.0±3.2 10.4±3.7 9.8±1.2 10.3±1.3 10.2±2.6 11.4±2.4 CCD+AS 20.1±2.3 16.5±2.0 16.9±2.2＊＊ 15.7±3.2＊＊ 13.1±2.5* 10.8±1.7 11.8±0.5 CCD+MM 19.6±0.9 16.2±2.8 11.4±3.0 9.8±2.6 10.3±2.0 10.6±2.0 10.4±1.7 Sham+NS 20.2±2.3 19.4±2.4 20.1±1.2 20.6±2.419.6±2.7 19.4±2.0 18.6±1.8

表2 鞘内注射Cav3.3反义寡聚核苷酸对CCD大鼠机械痛阈的影响(±s，n=8)

表2 鞘内注射Cav3.3反义寡聚核苷酸对CCD大鼠机械痛阈的影响(±s，n=8)

注:*P＜0.05，＊＊P＜0.01 VS CCD+NS组

组别MWT(g)术前 术后1 术后3 术后5 术后7 术后10 术后14 CCD+NS 14.1±1.9 4.4±0.5 4.0±2.1 2.9±1.2 4.5±0.5 3.5±1.1 3.4±1.2 CCD+AS 13.8±2.3 4.4±1.0 7.7±3.4＊＊ 7.7±2.1＊＊ 6.1±1.7* 4.0±1.3 5.4±1.8 CCD+MM 14.8±0.5 4.2±0.6 4.4±1.0 4.3±0.6 4.4±1.4 3.9±0.9 4.0±1.6 Sham+NS 15.0±0.0 13.8±2.3 12.8±3.1 13.1±1.913.4±1.6 13.1±1.8 13.4±1.9

3 讨论

外周或中枢神经系统的损伤或功能紊乱引起神经病理性痛，表现为自发痛、痛觉过敏和触诱发痛。T型钙通道属于低电压依赖性钙通道，具有快速失活、缓慢关闭的特点，对调节神经元的兴奋性有重要作用。脊髓背角伤害感受性神经元的敏感化(中枢敏化)是引起病理性疼痛慢性痛觉过敏的重要原因之一。研究表明脊髓T型钙通道与脊髓背角神经原的长时程增强有关，参与中枢敏感化的形成［7］。

T型钙通道有三种亚型，在不同的组织中有不同亚型的T型钙通道的表达。用Northern blot方法对T型钙通道的mRNA的表达的研究表明，Cav3.1 mRNA主要在人脑表达，在卵巢，胎盘和心脏中以及胎儿的肾脏和肺组织中也有表达。Cav3.2 mRNA主要在肾脏和肝脏中表达，同时在心脏，脑组织，脊髓、胰腺，胎盘，肺以及骨骼肌和肾上腺皮质中都有表达。Cav3.3 mRNA几乎仅仅表达在脑和脊髓组织中，在外周组织中仅肾上腺皮质和甲状腺有表达。在中枢神经系统，许多脑区同时表达多种亚型的T型钙通道，如嗅脑颗粒细胞和海马锥体细胞都同时表达上述3种亚型［8］。背根节神经原主要表达Cav3.2和Cav3.3，并且仅限于那些小的或中等大小的神经原中才有表达［9］。不同亚型的T型钙通道表达可能有不同的作用，有作者认为［10］，中枢神经系统中 Cav3.2和Cav3.3具有致痛作用，而Cav3.1则具有镇痛作用。

T型钙通道通过调节细胞的兴奋性和神经递质如谷氨酸、P物质和钙基因相关肽的释放，参与中枢敏感化和紧发条windup现象的形成。由于它在接近静息膜电位下就可以活化，使得钙离子在静息状态下或阈下电位就可以进入细胞内，增加神经元的兴奋性，产生阈下膜电位，导致钠依赖性动作电位的形成，在疼痛信号传递中有启动作用。

早期由于缺少选择性阻断剂等药理学工具，T型钙通道的生理特征、作用到目前为止还是知之甚少，随着分子生物学和电生理研究的进步，对T型钙通道在生理病理下的功能和结构的研究日益增多。近年来，神经系统的T型钙通道与疼痛关系的研究引起人们的重视，Ahmet等［11］发现T型钙通道参与吗啡耐药，吗啡依赖和吗啡戒断综合征的形成，并且鞘内注射T型钙通道选择性抑制剂米贝地尔能增强吗啡的镇痛作用。Dogrul［12］给部分脊神经结扎大鼠腹腔内或感受区局部注射米贝地尔能明显减轻大鼠的痛敏。虽然米贝地尔对T型钙通道的选择性较强，但大剂量时也可以阻断其它离子通道，包括N型和R型钙通道，而N型和R型钙通道已被证明和病理性疼痛有关。本实验采用鞘内注射Cav3.3T型钙通道反义寡聚核苷酸，由于其能特异性与靶mRNA结合，从而空间占据并阻断mRNA的转录，进而减少蛋白质的表达，具有较强特异性，因此我们选择直接鞘内给药的方法，使其在脊髓表层的浓度相对较高，而达到最佳效率并减少由于静脉或者其他给药方式所造成内生核酶的降解。

在本实验中，我们采用慢性背根节压迫模型，其产生的神经痛同临床上腰椎间盘突出、椎管狭窄等慢性痛极为相似，是研究慢性痛的常用模型。大鼠在CCD手术后1 d开始表现为明显的痛敏，并且持续稳定的存在，鞘内连续注射Cav3.3反义寡聚核苷酸(每天两次，连续4 d)能延缓CCD大鼠痛敏的形成，直到CCD手术后10 d，反义寡聚核苷酸组大鼠才与生理盐水组产生同样的痛敏，而Cav3.3错义核苷酸组与生理盐水组无统计学差异，提示脊髓Cav3.3参与CCD大鼠神经病理痛的形成。

可见，脊髓Cav3.3亚型在神经病理性疼痛的形成和维持中可能具有重要作用，抑制脊髓Cav3.3基因的表达具有疼痛治疗作用。因此，开发有临床应用价值的选择性抑制Cav3.3表达的药物有可能成为慢性疼痛治疗的一个方向。

［1］陈志新，文先杰，曾因明，等.鞘内和侧脑室内注射米贝地尔对慢性坐骨神经松结扎大鼠机痛阈的影响.中国药理学通报，2006，22(5):571-575.

［2］McRory JE，Santi CM，Hamming KS，et al.Molecular and functional characterization of a family of rat brain T-type calcium channels.Journal of Biological Chemistry，2001，276(6):3999-4011.

［3］胡三觉，邢俊玲.大鼠背根节慢性压迫对行为和电生理反应的影响.中国疼痛医学杂志，1997，3(3):158-65.

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［5］Chaplan SR，Bach FW，Pogrel JW，et al.Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw.J Neurosci Methods，1994，53(1):55-63.

［6］Chen J，Luo C，Li HL，et al.Primary hyperalgesia to mechanical and heat stimuli following subcutaneous bee venom injection into the plantar surface of hind paw in the conscious rat;A comparative study with the formalin test.Pain，1999，83(1):67-76.

［7］Ikeda，H.Synaptic plasticity in spinal lamina I projection neurons that mediate hyperalgesia.Science，2003，299(5610):1237-1240.

［8］Alley EM，Cribbs LL，Lee JH，et al.Differential distribution of three members of a gene family encoding low voltage-activated(T-type)calcium channels.J Neurosci，1999，19:1895-1911.

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［10］Kim，D.Thalamic control of visceral nociception mediated by T-type Ca2+channels.Science，2003，302:117-119.

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［12］Dogrul A，Gardell LR，Ossipov MH，et al.Reversal of experimental neuropathic pain by T-type calcium channel blockers.Pain，2003，105(1-2):159-168.