彭 艳，廖雅桦，肖 遂，柳 立

(1湖南农业大学作物基因工程湖南省重点实验室，长沙410128;2湖南农业大学烟草科学与健康重点实验室，长沙410128)

有机酸不仅在烟草生长过程中起着重要的作用，而且对烟草和卷烟的质量有着重要的影响，尤其是挥发酸，尽管含量很低，但其对烟草感官质量的影响却远远大于多元酸和高级脂肪酸[1]。烟草中的挥发性酸多为C10以下的低级脂肪酸和部分芳香族酸，乙酸和甲酸是主要的挥发酸，次要挥发酸包括丙酸、α－呋喃酸、苯甲酸、α－甲基丁酸、β－甲基戊酸和许多其它酸类[2～4]。烟草中的挥发性低级脂肪酸对卷烟香味有显著影响，特别是戊酸、异戊酸和β－甲基戊酸，可赋予卷烟甜味、水果味和醇和的乳酪香味。因此，研究烟草中挥发性酸的种类对了解各种烟草内在质量和制定卷烟配方有重要指导意义。笔者应用气相色谱直接进样对目前常见的5种不同前处理方法水蒸气蒸馏法、超声波提取法、酸碱分离法、同时蒸馏萃取法以及同时蒸馏萃取和酸碱分离相结合的方法进行了比较，并对云南4个产区(曲靖、昭通、文山和昆明)的云烟87的C3F初烤烟叶进行分析，旨在找出烟草中挥发性有机酸的最佳提取和分离方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以湖南中烟工业公司提供的云烟87的C3F为材料，样品分别取自云南的曲靖、昭通、文山和昆明。

1.2 试验方法

1.2.1 水蒸汽蒸馏法[5]

取25 g烟样置500 mL烧瓶中，加8倍量pH=1.5的磷酸浸泡24 h，水蒸馏装置蒸馏，至馏出液达60 mL。然后分别用40 mL二氯甲烷萃取3次，合并二氯甲烷萃取液，浓缩至1 mL，进行GC分析。

1.2.2 超声波提取

取10 g烟叶置三角瓶中，加入50 mL pH=1.5的磷酸溶液，浸泡2 h，超声处理30 min，滤过，滤液用20 mL二氯甲烷萃取3次，浓缩至1 mL，进行GC分析。

1.2.3 酸碱分离法[6]

向装有1.0 g烟末样品的40 mL带盖试管中加入W(NaOH)=4%溶液10 mL，振荡30 min后，冷冻挥干，加入W(H2SO4)=10%溶液10 mL，振荡30 min后，再加入10 mL CH2Cl2振荡60 min离心，分离两相后，取出有机相，用无水Na2SO4脱水过滤，将滤液浓缩至1 mL，进行GC分析。

1.2.4 同时蒸馏萃取过程(SDE)[7]

称取25.0 g烟末，进行同时蒸馏萃取。即将烟末置于萃取装置一端的1 000 mL平底烧瓶中，加入350 mL水溶液，用电炉加热。在装置另一端的100 mL平底烧瓶中加入40 mL二氯甲烷，置于60℃的水浴中加热，同时蒸馏萃取2 h，浓缩至1 mL，进行GC分析。

1.2.5 同时蒸馏萃取+酸碱分离过程(SS)[8]

同时蒸馏萃取过程与上述一致。同时蒸馏萃取结束后，进行酸碱分离，即把二氯甲烷溶液用25 mL4%的氢氧化钠溶液洗涤3次，合并3次洗涤后的氢氧化钠溶液，往其中缓缓加入15 mL20%的盐酸溶液。然后分别用25 mL二氯甲烷萃取3次，合并二氯甲烷萃取液，浓缩至1 mL，进行GC分析;

1.3 色谱条件

气相色谱仪(意大利 finnigan)，FID检测器，分析柱:HP－FFAP(30 m×0.25 m mid×0.32 umdF);载气为N2;恒流模式，流量1.0 mL/min;进样口温度220℃;检测器温度:250℃;程序升温:60℃ (1 min)——220℃(10 min)，2℃ /min;进样量 1 μL;不分流进样。

1.4 标准溶液的配置

准确量取乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、β－甲基戊酸、己酸、巴豆酸各10 μL，混合标样用二氯甲烷定容到10 mL，吸取1 mL，稀释到5 mL。各标样的浓度见表1，标准样品谱图如图1。

表1 标准样品浓度(单位:μg/mL)

2 结果与分析

2.1 不同前处理方法的比较

试验过程中选用5种不同的前处理方法对挥发酸的提取进行了比较，其结果如图2～6。

由图2可见，水蒸汽蒸馏法能提取出3种挥发酸，而且对己酸有很好的提取效果，但对于5碳以下的低分子量的脂肪酸提取效果较差。由图3可见，超声波提取操作简单，而且对于小分子的挥发酸有很好的提取效果，但对于5个碳以上的挥发酸提取效果明显比水蒸气蒸馏法差。由图4可见，酸碱分离法对乙酸和戊酸的提取效果很好，但却很难将其他成分提取出来。5种提取方法中以同时蒸馏萃取过程(SDE)和同时蒸馏萃取+酸碱分离过程(SS)效果最佳，但SDE处理提取的挥发酸含量明显没有SDE+SS过程的高，因此选择同时蒸馏萃取+酸碱分离过程(SS)为最佳前处理方法。

图1 标准样品谱图

图2 水蒸汽蒸馏法谱图

图3 超声波提取谱图

图4 酸碱分离法谱图

图5 同时蒸馏萃取过程(SDE)谱图

图6 同时蒸馏萃取+酸碱分离过程(SS)谱图

2.2 工作曲线

准确量取丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、β－甲基戊酸和己酸各10 μl，混合标样用二氯甲烷定容到10 mL，吸取1 mL，稀释到5 mL，GC 分析，重复5次，采用平均相应因素法做定量标准曲线，结果见表2。从表2可知这6种标样都具有良好的线性，线性相关系数均高于0.98。

表2 定量分析方法的线性方程、回收率和精密度

2.3 回收率

采用加标法，即在烟草样品中加入适量的混合标样，采用与烟草样品前处理相同的实验步骤，进行定量计算。连续测定5组样品后得到各有机酸的测定值，取平均值，按回收率(%)=[测定值(烟样+标样)－测定值(烟样)]/标样加入量×100，计算出各种挥发酸的回收率。表2数据结果表明，6种标准样品的回收率均高于80%，可以用于烟草样品挥发性有机酸的定量分析。

2.4 精密度

精密度试验，取同一个均匀烟叶样品，按相同的前处理实验步骤，进行定量计算，连续测定5组样品后，按下列公式求得变异系数。从表2中可以看出，6种定量组分的变异系数大多数控制在5%以内，个别超过5%，最大的变异系数不超过8%，表明实验具有较好的重复性，结果可信。

2.5 样品分析

采用同时蒸馏萃取加酸碱分离法，对云南4个产区云烟87中部叶烟草样品进行分析，定量分析结果如表3所示。该数据有较好的回收率和重复性，结果可信，比较适应于烟草样品挥发性有机酸的定性定量分析。

表3 云南烤烟中挥发性有机酸含量(μg/g)

3 结论与讨论

本试验研究结果表明，在前处理方法选择上，以同时蒸馏萃取+酸碱分离过程效果最佳。而其它4种方法不能作为挥发酸提取的前处理方法，主要是因为:(1)低分子量的脂肪酸的水溶性和挥发性较强，有机溶剂很难将其萃取完全，而且每次蒸馏出的水量将直接影响到挥发酸含量的稳定性;(2)超声和振荡对样品的破坏太小，部分挥发酸不能完全析出;(3)同时蒸馏萃取法虽克服了其他3种方法的缺陷，但烟叶样品中成分复杂，挥发酸在挥发的同时挥发碱和其他成分，有可能酸和碱结合而影响挥发酸含量的测定，这也是本试验结果与李炎强等[9]研究结果不同的原因。

研究还表明，在定量分析上，6种标准样品的回收率均高于80%，6种定量组分的变异系数除异丁酸和丁酸外，其他大多数控制在5%以内，个别超过5%，最大的变异系数不超过8%，实验具有较好的重复性，实验结果是可信的，可以用于烟草样品挥发性、半挥发性有机酸的定量分析。

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