陈 洁，吕天喜，叶竞雄，赵玉玲

（浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华321004）

金佛手总黄酮的超声提取工艺研究

陈 洁，吕天喜，叶竞雄，赵玉玲*

（浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华321004）

通过单因素以及正交实验对金佛手总黄酮进行了超声波提取的工艺研究，采用氢氧化钠-亚硝酸钠-硝酸铝法测定了金佛手总黄酮的含量。结果表明，超声波辅助提取金佛手总黄酮的最佳工艺条件为：60%乙醇水溶液（v/v）、料液比1∶10（g/mL）、超声温度35℃、超声时间15min，此条件下佛手总黄酮的含量为36.753mg/g。该方法简单、快速、经济，可作为金佛手总黄酮提取的一种有效手段。

金佛手，总黄酮，超声提取，正交实验

佛手主要分布于热带和亚热带，我国浙江、江西、福建、广东、广西、四川、云南等地均有栽培[1]，其中产于浙江金华的佛手雅称“金佛手”。佛手具有多种药理作用，主要化学成分为香豆素类和黄酮类[2-4]。佛手柑是芸香科柑橘属植物佛手（Citrus medica var sarcodactylis）的果实，味辛、苦、酸，性温，入肝、胃、肺经，具有舒肝和胃、行气止痛、祛湿化痰等功效[5]。黄酮类是指以黄酮（2-苯基-苯并-g-吡喃酮）为母体的一大类化合物，广泛分布于植物界，主要存在于芸香科、唇形科、豆科、伞形科、银杏科以及菊科植物中，是许多中草药的有效成分。现代药理研究证明，黄酮类化合物在心血管系统、内分泌系统和抗肿瘤方面具有明显的药理作用。超声波提取植物中的黄酮类物质是目前较新的方法[6-7]，在川佛手总黄酮提取中得到了最佳工艺[8]，但在金佛手总黄酮的提取中还未见报道。本文采用超声波辅助提取金佛手总黄酮，对乙醇浓度、料液比、超声时间和超声温度等四个影响因素进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

成熟佛手鲜果 购自浙江金华花卉市场，外观如观音手，色泽金黄油亮；芦丁标准品 中国药品检验所，纯度＞98%；无水乙醇、氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠 国药集团药业股份有限公司，分析纯；实验用水 蒸馏水，自动三重纯水蒸馏器烧制。

电子分析天平 赛多利斯科学仪器北京有限公司；Lambda25紫外-可见分光光度计 美国Perkin Elmer公司；KQ-5200B型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；R1001V旋转蒸发仪、DEF-300真空干燥箱 郑州长城科工贸有限公司；Science-IID细胞破碎仪 上海京工实业有限公司；SZ-97A自动三重纯水蒸馏器 上海亚荣生化仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 制样 将新鲜佛手切成均匀薄片，放入托盘，于50～60℃鼓风干燥24h，自然冷却后粉碎，过60目筛备用。

1.2.2 佛手总黄酮的提取工艺 精密称取佛手粉1g共9份，按照一定料液比加入不同浓度乙醇水溶液浸泡24h。在超声波清洗槽中提取，用真空泵抽提过滤，将提取液用旋转蒸发仪减压浓缩，回收乙醇。滤液转移入100mL容量瓶，用相同浓度的乙醇溶液稀释至刻度。

1.2.3 芦丁标准溶液的配制 精密称取芦丁标准品0.0500g，用60%乙醇水溶液溶解，在100mL容量瓶中定容，摇匀，得到浓度为0.5000mg/mL的芦丁标准液。

1.2.4 测定波长的选择 分别取样液和芦丁标准液各10mL于50mL容量瓶中，用50%乙醇水溶液稀释至约25mL，加入1.4mL亚硝酸钠（5%）摇匀，静置6min；然后加入1.4mL硝酸铝（10%），摇匀，静置6min；最后加入10mL氢氧化钠（1mol/L），静置10min。以50%乙醇水溶液为空白参比，在紫外-可见分光光度计上扫描300～700nm范围内的图谱（图1）。由图谱可知，芦丁标准品355nm处的吸收强于510nm，而佛手样液在355nm处有最大吸收，因此选取355nm作为测定中的最大吸收波长。

图1 芦丁标准品和佛手样液的吸收光谱Fig.1 Absorption spectrum of rutin standard and bergamot sample liquid

1.2.5 芦丁标准曲线及回归方程的建立 分别取0、2、4、6、8、10mL芦丁标准液于50mL容量瓶中，用50%乙醇水溶液稀释至约25mL，加入1.4mL亚硝酸钠（5%）摇匀，静置6min；然后加入1.4mL硝酸铝（10%），摇匀，静置6min；最后加入10mL氢氧化钠（1mol/L），静置10min。以试剂做空白参比，紫外-可见分光光度计上测355nm处吸光度，记录数据。以芦丁标准液浓度（mg/mL）为横坐标，以吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.6 佛手总黄酮提取的单因素实验

1.2.6.1 乙醇浓度对总黄酮含量的影响 精密称取佛手粉1g 5份，分别加入30%、50%、60%、70%、90%的乙醇水溶液30mL，于45℃水浴超声10min，过滤、定容，按1.2.5方法测定总黄酮含量。

1.2.6.2 料液比对黄酮含量的影响 精密称取佛手粉1g 5份，分别按料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25加入60%乙醇水溶液，于45℃水浴超声10min，过滤、定容，按1.2.5方法测定总黄酮含量。

1.2.6.3 超声时间对黄酮含量的影响 精密称取佛手粉1g 5份，加入60%乙醇水溶液30mL，于45℃水浴分别提取10、15、20、25、30min，过滤、定容，按1.2.5方法测定总黄酮含量。

1.2.6.4 超声温度对黄酮含量的影响 精密称取佛手粉1g 5份，加入60%乙醇水溶液30mL，分别于15、 25、35、45、55℃水浴中超声提取10min，过滤、定容，按1.2.5方法测定总黄酮含量。

1.2.7 正交实验设计 在单因素实验基础上，选择乙醇浓度、料液比、超声时间和超声温度四个因素，按照正交实验四因素三水平设计（表1），以佛手中总黄酮的含量为指标，进行正交实验。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

1.2.8 佛手总黄酮的测定 分别取待测提取液各10mL，按标准曲线的绘制方法测定提取液的吸光度值，根据标准曲线回归方程计算佛手总黄酮含量。

佛手总黄酮含量（mg/g）=佛手总黄酮质量（mg）/原料佛手总质量（g）

2 结果与讨论

2.1 标准曲线的绘制

由图2可以看出，在0～0.10mg/mL范围内，芦丁浓度与吸光度之间具有良好的线性关系，线性相关性为0.9997，线性回归方程为：y=18.539x+0.0126，其中x表示芦丁浓度，y表示355nm处的吸光度。

图2 芦丁标准曲线Fig.2 Rutin standard curve

2.2 佛手总黄酮提取的单因素实验

图3 乙醇浓度对总黄酮含量的影响Fig.3 Effect of ethanol concentration on total flavonoids content

分别对影响佛手黄酮含量的单因素乙醇浓度（%）、料液比（g/mL）、超声时间（min）和超声温度（℃）进行了研究。

2.2.1 乙醇浓度对总黄酮含量的影响 由图3看出，随着乙醇浓度的提高，总黄酮含量不断提高，其原因可能是因为随着乙醇浓度的增加，脂溶性物质溶出增多。乙醇浓度60%～70%时总黄酮含量达到最高，随后开始下降，这可能是由于部分黄酮类化合物是水溶性的，若水分含量太少，黄酮类化合物不能充分溶解[9]。

2.2.2 料液比对总黄酮含量的影响 从图4可以看出，随着料液比的增加，总黄酮含量不断下降，在料液比超过1∶15后，总黄酮含量的下降趋势趋于平缓。其原因与乙醇浓度对黄酮含量的影响类似，过高的乙醇浓度对黄酮的提取并无太大益处，因为在佛手总黄酮的测定中，还有棕榈酸等水溶性物质的存在[3-4]。

图4 料液比对总黄酮含量的影响Fig.4 Effectofratioofmaterialtoliquidontotalflavonoidscontent

2.2.3 超声时间对总黄酮含量的影响 随着超声时间的增加，佛手中总黄酮含量逐渐提高，超过15min时，提取率反而有所降低（图5）。其原因可能是随着时间的增加，样品中黏液质等杂质进入抽提液，使抽提液黏度增大，扩散速度变慢，导致黄酮类化合物不易溶出[7]。

图5 超声时间对总黄酮含量的影响Fig.5 Effect of ultrasonic time on total flavonoids content

2.2.4 超声温度对总黄酮含量的影响 从图6可以看出，佛手中总黄酮含量随着超声温度的升高逐渐增加，但当温度超过35℃后，黄酮含量趋于平缓。其原因可能是温度的升高会使溶剂少量挥发，杂质溶出量增加，从而对提取率稍有影响，且成本费用也有所增加[7]。

图6 超声温度对总黄酮含量的影响Fig.6 Effect of ultrasonic temperature on total flavonoids content

2.3 正交实验

L9（34）正交实验不同条件下佛手中总黄酮的含量及极差分析见表2，方差分析见表3。

表3 方差分析表Table 3 Analysis results of variance

结果表明，四种因素对佛手中黄酮含量的影响顺序依次为乙醇浓度（A）＞料液比（B）＞超声时间（C）＞超声温度（D），最佳工艺条件为A2B1C2D1，即用60%乙醇水溶液（v∶v），料液比为1∶10（g/mL），于35℃超声提取15min。在此条件下，重复提取3次，得到佛手中总黄酮平均含量为36.753mg/g。

3 结论

研究结果表明，超声波提取佛手中总黄酮的最佳工艺为：用60%乙醇水溶液（v∶v），料液比为1∶10（g/mL），于35℃超声提取15min，此条件下佛手中总黄酮的含量为36.753mg/g。有关佛手总黄酮的纯化以及抗氧化活性，则需要进一步研究。

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Study on the ultrasonic extraction technology of total flavonoids from citrus bergamot

CHEN Jie，LV Tian-xi，YE Jing-xiong，ZHAO Yu-ling*
（College of Chemistry and Life Science，Zhejiang Normal University，Jinhua 321004，China）

The technical study on the ultrasonicwave-assited extraction of total flavonoids from citrus bergamot by experiment of single factor and orthogonal test has been studied.The total flavonoids content was obtained by sodium hydrate-sodium nitrite-aluminum nitrate assay.It showed that the best technological conditions about the ultrasonicwave-assited extraction of total flavonoids from citrus bergamot were as follows：60% ethanol water（v/v），1∶10 ratio of material to liquid（g/mL），35℃ for 15min.The content of total flavonoids from citrus bergamot was 36.753mg/g in the best technological conditions.This method was simple，quick and economical，which could be an available assay for total flavonoids from citrus bergamot.

citrus bergamot；total flavonoids；ultrasonic extraction；orthogonal test

TS255.1

B

1002-0306（2012）05-0262-04

2011－05－31 *通讯联系人

陈洁（1989-），女，学士，研究方向：应用化学。

浙江师范大学博士科研启动基金（ZC304009077）；浙江师范大学第五期大学生研究性学习与创新实验项目（71）。